【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细菌生物膜清除剂开发，具体涉及一种可原位产生纳米co气体用于清除细菌生物膜的微球及其制备方法与应用。
技术介绍
1、细菌生物膜(bacterial biofilm，bf，或称菌膜、细菌生物被膜)是指附着于物体表面被细菌胞外大分子包裹的有一定三维结构和功能的细菌群体，主要包括胞外聚合物(extracellular polymeric substances，eps，由多糖、蛋白质、脂质、胞外dna等组成)及其包裹的细菌等。细菌生物膜广泛存在于各类细菌之中，与约80％的细菌感染有关，是细菌对现有抗生素产生耐受性和耐药性的主要原因之一。
2、顽固性细菌生物膜感染严重威胁着人类的生命安全。一旦感染发生，细菌倾向于在界面处形成微生物聚集体并定植在组织中，而不是以浮游细菌大量存在。呼吸代谢作用驱动细菌分泌大量细胞外聚合物质并形成紧密的生物膜，极大提高了细菌生存能力，包括阻止抗生素渗透、防御物理化学冲击和逃逸免疫细胞等，这进一步导致了感染加剧和反复感染。
3、起初，临床中针对细菌生物膜感染的主要治疗手段是使用大量抗生素和手术切除病灶，然而大剂量抗生素会导致细菌耐药性和严重的并发症。因此，开发新型抗生物膜药物具有重要意义。目前的抗生物膜剂主要有3类：生物膜形成抑制剂、生物膜分散剂和生物膜清除剂。其中，生物膜清除剂不同于另外两种，可作为单药杀死生物膜内细菌并清除生物膜，是一种具有潜力的抗菌药物。
4、早期的生物膜清除剂研究集中在抗菌肽和季铵类阳离子化合物。这类化合物主要模拟靶向并改变细胞膜通透性的抗
5、目前，常用的生物膜治疗药物分为小分子药物(β-内酰胺类、四环素类和氟喹诺酮类等)和大分子药物(多肽、蛋白质和聚糖等)。然而，小分子药物破坏细菌细胞膜与细菌代谢状态密切相关，大分子药物渗透性差，均无法真正渗透并毁灭细菌生物膜。
6、目前，多种智能纳米抗生素递送载体(金属基纳米载体，无机纳米载体，有机纳米载体以及复合纳米载体)已经被发展用于治疗细菌感染，但是这些载体仅仅靶向感染性的生物膜，不能深入渗透并清除细菌生物膜。
7、尽管多种杀菌策略被开发用于清除细菌生物膜，包括精确递送抗生素、物理信号杀菌和化学信号杀菌，但是，细菌生物膜的耐药性和难渗透性一直困扰着人们。呼吸驱动的细菌生物膜耐药性和不渗透性仍然导致了无法治愈的感染。干扰细菌呼吸是消灭细菌生物膜的关键，但打破生物膜屏障破坏细菌呼吸至今仍然缺乏有效手段。
8、呼吸作用驱动细菌生物膜形成和扩散，其本质在于通过氧化还原过程获取能量并占据生态位。作为兼性厌氧菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)在富氧和乏氧环境中都能生长，其独特的呼吸作用能够利用分子氧或替代电子受体实现能量传递。生物膜中，氧气浓度由外层到内层逐渐降低，外层细菌直接利用氧气表现出代谢活跃，而内层乏氧环境迫使细菌利用替代电子受体将电子从胞内的nadph传递到生物膜外层的氧气，从而获得能量并表现出代谢缓慢。更多地，氧气限制导致生物膜内部氧化还原状态失衡，细菌降低磷壁酸表达同时高表达alta鼠蛋白水解酶破坏细胞壁，这一过程促使生物膜增加其比表面积获得氧气，表现为生物膜扩散。因此，阻断细菌呼吸代谢是实现无耐药性清除细菌生物膜的理想选择。
9、现有针对mrsa的抗菌物质(如万古霉素、ll37等)，虽然表现出对mrsa悬浮菌具有较好的杀菌效果，但是对于生物膜的破坏效果明显不足，究其原因是这类抗菌物质无法阻断细菌呼吸代谢，从而无法实现清除细菌生物膜。
10、因此，开发一种能够高效清除细菌生物膜感染，且能够破坏细菌呼吸链，消除细菌生物膜的交错，并具有很好生物膜渗透性的药物治疗策略，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术就是为了解决上述技术问题，从而提供一种可原位产生纳米co气体用于清除细菌生物膜的微球及其制备方法与应用。本专利技术的技术目的在于，提供一种能够破坏细菌呼吸链，并能够高效渗透细菌生物膜，用于高效清除细菌生物膜感染的水凝胶微球，特别是对于去除耐药生物膜具有极佳的效果。
2、本专利技术首先提供了一种可原位产生纳米co气体的微球的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)取corm-401进行edc/nhs活化后，加入到caco3的水溶液中进行反应，制备得到caco3@corm-401；
4、(2)取caco3@corm-401、甲基丙烯酸化明胶水凝胶和光引发剂，分散于水中作为水相，以span80和液体石蜡作为油相，通过微流控装置制备微球液滴，然后经冷冻后光交联，制备得到gelma@caco3@corm-401微球；
5、(3)将ll37多肽溶液经edc/nhs活化，然后加入到gelma@caco3@corm-401微球分散液中反应，制备得到gelma@caco3@corm-401@ll37微球。
6、一氧化碳(co)中毒被视为隐形杀手导致人类死亡，其主要原因是c≡o键较o＝o键更容易与fe离子形成fe＝c＝o导致组织缺氧。因此，co有望竞争氧气与fe离子配位使细胞色素氧化酶失活从而破坏细菌生物膜。
7、不同于传统药物的作用方式，与氧气竞争的co不会诱发细菌产生耐药性。此外，co气体在生理环境中表现出强大的稳定性，这使得它可以在远处发挥治疗作用。值得关注的是，细菌生物膜感染治疗失败的一个主要原因是生物膜内治疗剂的低渗透性和富集，co的超低分子量使其能够自由扩散到生物膜中，诱导细菌连续中毒，从而分解生物膜并发挥杀菌作用。
8、本专利技术人基于呼吸作用驱动细菌生物膜形成机制及co气体竞争氧气破坏细菌呼吸链的启发，设计合成了一种由gelma制备的细菌呼吸破坏微球，包括酰胺反应接枝的ll37抗菌肽和纳米碳酸钙偶联的corm-401分子。首先，原位产生纳米co气体的细菌呼吸破坏微球利用ll37抗菌肽的正电特性和α-螺旋结构可以快速定位到生物膜表面，接着caco3@corm-401响应感染部位的酸性和ros微环境释放纳米co气体干扰细菌呼吸作用，从而阻断细菌获取atp并破坏其生物膜生态位。
9、体外实验表明，细菌呼吸破坏微球独特的正电和α-螺旋结构快速定位细菌生物膜并响应感染微环境释放纳米co气体，这阻断了细菌呼吸作用，最终杀死细菌并破坏生物膜生态位。体内实验表明，呼吸破坏微球能够清除细菌生物膜并恢复内环境稳态促进组织再生。因此，基于破坏呼吸策略下构建的细菌呼吸破坏微球为清除细菌生物膜提供了一种新型的无耐药性治本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可原位产生纳米CO气体的微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化的时间为15min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述反应的时间为8h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述CaCO3与CORM-401的重量比为10：1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲基丙烯酸化明胶水凝胶的制备方法为：将明胶加入到PBS缓冲液中，加热至明胶完全溶解，然后加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后的溶液经透析、冻干，得到甲基丙烯酸化明胶水凝胶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中负载CaCO3的CORM-401、甲基丙烯酸化明胶水凝胶和光引发剂的重量比为1：100：10。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述光引发剂为LAP。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中负载CaCO3和CORM-
9.由权利要求1-8任一项所述方法制备得到的可原位产生纳米CO气体的微球。
10.权利要求9所述的可原位产生纳米CO气体的微球在制备细菌生物膜清除剂的药物方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种可原位产生纳米co气体的微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化的时间为15min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述反应的时间为8h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述caco3与corm-401的重量比为10：1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲基丙烯酸化明胶水凝胶的制备方法为：将明胶加入到pbs缓冲液中，加热至明胶完全溶解，然后加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后的溶液经透析、冻干，得到甲基丙烯酸化...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔文国，张宏博，庄彭真，
申请(专利权)人：上海市伤骨科研究所，
类型：发明
国别省市：
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