【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种新型小型化car设计及制备方法和应用。
技术介绍
1、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,her2)是一种细胞来源的原癌基因，又称为c-erbb-2基因，在多种肿瘤中过度表达和扩增。过多的her2蛋白出现在肿瘤细胞表面会促进肿瘤细胞的分裂和生长，进而形成her2阳性肿瘤。her2过表达常见于乳腺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中。
2、car-t细胞疗法(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy)全称为嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，是一种新型的治疗肿瘤的精准靶向疗法。研究发现，car-t细胞能够精准、快速、高效、特异地识别并杀伤肿瘤细胞，近几年通过优化改良在协助肿瘤的治疗上取得了良好的效果，是一种非常有前景且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗研究方向。但目前car-t疗法在不同肿瘤,尤其是在实体瘤的效果上仍存在争议，实体瘤是car-t疗法亟待攻克的一个具有挑战性的目标。
3、研究发现car结构中任何一个部分的微小改变都会对car-t细胞的抗肿瘤活性产生影响。其中，不同的scfv、铰链区、跨膜区、共刺激域或itams都可能影响car-t细胞的效应性。一方面，t细胞需接受抗原刺激才能被激活和扩增,但过度激活以及对靶标的过度亲和可能导致t细胞耗竭和杀伤活性降低,影响car-t细胞的持久性。
4、1990年代后期设计的第一代car包含cd3ζ或fcrγ信号结
5、综上所述，本专利技术将提供一种结构改良的新型小型化car设计及car-t细胞，以缓解现有技术的不足。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种新型小型化car设计及制备方法和应用，具体技术方案如下。
2、一种新型小型化的嵌合抗原受体，结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域为纳米抗体，所述胞内结构域为截短的cd3ζ与4-1bb串联，所述嵌合抗原受体为小于300个氨基酸。
3、在一些优选实施例中，所述car结构的蛋白序列的长度为281个氨基酸。
4、进一步，所述截短的cd3ζ为cd3ζitam1结构域，核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、进一步，所述嵌合抗原受体还包括cd8铰链区。
6、表达上述任一项所述的嵌合抗原受体的car-t细胞。
7、进一步，所述car-t细胞靶向实体瘤和血液瘤。
8、进一步，所述实体瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌。
9、可选的，本申请提供一种靶向治疗her2阳性表达实体肿瘤的药物，所述药物包括上述car-t细胞和药学上允许添加的辅料和/或助剂。
10、上述car-t细胞在制备靶向实体肿瘤和血液瘤药物中的应用，所述car-t细胞的cd3ζitma1结构域用于适当激活t细胞下游信号。
11、在一些实施例中，所述实体肿瘤可选的为her2阳性表达的实体肿瘤。
12、进一步，所述实体肿瘤还包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌等。
13、上述嵌合抗原受体的制备方法，包括以下步骤：
14、1)用基因合成的方法构建包含纳米抗体、cd8铰链区、跨膜区、4-1bb共刺激分子以及截短cd3ζ信号域的car结构片段；
15、2)用限制性内切酶分别对表达载体和合成的car结构片段进行双酶切，以t4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定。
16、进一步，所述截短cd3ζ信号域为cd3ζitam1结构域。
17、有益技术效果
18、本专利技术提供的car结构是一种新型小型化的二代car结构，该car结构的蛋白序列长度不到300个氨基酸，截短的cd3ζ信号域仅与一个4-1bb胞内信号域相连，其可以证明在多种肿瘤(包括实体肿瘤和血液瘤)上具有较好的效果。cd3ζ信号域包括cd3ζitam1、itam2和itam3，目前尚未见只采用cd3ζitam1部分合成的car及制备的car-t细胞在靶向实体瘤中具有良好效果的相关报道，因此本专利技术具有一定的开创性。
19、其次，本专利技术的car-t细胞仅保留cd3ζitam1结构域，实验证明已到达足以激活t细胞下游信号，促进car-t细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤的效果。此外，截短的cd3ζ信号域又可以避免t细胞下游信号过度激活对car-t细胞造成损伤，进而更好的发挥肿瘤杀伤作用。因此本专利技术制备的car-t细胞不仅具有有效的杀伤能力，还具有较好的杀伤持久性。
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1.一种新型小型化的嵌合抗原受体，结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域为纳米抗体，所述胞内结构域为截短的CD3ζ与4-1BB串联，所述嵌合抗原受体为小于300个氨基酸。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述截短的CD3ζ为CD3ζITAM1结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区。
4.一种CAR-T细胞，其特征在于，表达如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体。
5.如权利要求4所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞靶向实体瘤和血液瘤。
6.如权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述实体瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌。
7.权利要求4所述的CAR-T细胞在制备靶向实体肿瘤和血液瘤药物中的应用，其特征在于，所述CAR-T细胞的CD3ζITAM1结构域用于适当激活T细胞下游信号。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤还包
9.权利要求4所述的嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述截短CD3ζ信号域为CD3ζITAM1结构域。
...【技术特征摘要】
1.一种新型小型化的嵌合抗原受体，结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域为纳米抗体，所述胞内结构域为截短的cd3ζ与4-1bb串联，所述嵌合抗原受体为小于300个氨基酸。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述截短的cd3ζ为cd3ζitam1结构域，核苷酸序列如seq id no:2所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括cd8铰链区。
4.一种car-t细胞，其特征在于，表达如权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体。
5.如权利要求4所述的car-t细胞，其特征在于，所...
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