【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞染色，具体涉及一种细胞染色剂及其在病毒tcid50测定中的应用。
技术介绍
1、病毒清除/灭活验证一般采用添加指示病毒的方法来评估工艺步骤的病毒清除/灭活能力。病毒滴度（viral titer）指的是单位体积内活病毒或具有功能的病毒的含量，与病毒的致病能力息息相关，因此准确测定特定病毒的滴度对于病毒感染的防控和清除至关重要，同时也是定量扩增指示病毒必备的检测流程之一。通常病毒滴度用组织半数感染量终点滴定法tcid50（50% tissue culture infective dose）表示，也就是在特定时间内，在细胞培养板孔或试管内引起半数细胞病变效应（cytopathic effect, cpe）所需的最小病毒量。目前常用的病毒滴度的检测方法还有噬斑法（virus plaque formation）、实时荧光定量pcr法（quantitative real-time pcr，qpcr）、免疫细胞化学法（immunocytochemistry，icc）、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,elisa）、透射电镜法（transmission electron microscopes, tem）、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography, hplc）等等。不过tcid50法依旧是最常用的方法，相比于其他方法其具有成本较低、步骤较少、计算较简便等优势，但同时也存在一些缺陷，例如长时间使用肉眼观察光学显微镜下的细胞时可能
2、对此，专利cn201611194249.6在传统tcid50的基础上，将原本通过光学显微镜肉眼观察的细胞病变（cpe），变成利用抗猪细小病毒抗体结合，由辣根过氧化物酶来催化显色并检测吸光度值。但是过程中增加了大量不必要的工序、试剂采购和保存成本；并且，由于抗体具有特异性，此方法能够检测的病毒种类有限，泛用性差，当检测其他种类的病毒时需要重新制备抗体，进一步增加成本。专利cn202111244738.9用结晶紫染色法与tcid50结合，在观察细胞前用结晶紫对细胞进行染色，从而加深细胞的颜色，相比传统的tcid50更容易观察结果。不过该方法由于结晶紫的染色程度较深，在细胞固定和清洗染色液的过程中容易造成孔内细胞脱落引起实验结果不准确。专利cn201610522012.x用台盼蓝染色法与tcid50结合，理论上台盼蓝只能进入死细胞而不会染色活细胞，但在实际操作过程中，细胞密度过高时活细胞外周也会产生色素沉积，而通过tcid50法培养的敏感细胞恰好就会相互接触，最终导致背景颜色过深，不便于观察，难以区分活细胞与死细胞的差异。此外，极早期和早期病毒感染后cpe不明显，不会引起细胞死亡，此时台盼蓝无法进入细胞显色，从而会低估病毒的效力，造成系统误差，甚至导致病毒感染事故的发生。
3、因此，为降低细胞病变观察难度，提高病毒tcid50测定结果准确性，仍需开发适用于病毒tcid50测定中的指示细胞的染色方法及配套的细胞染色剂。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的问题是提供一种对病毒tcid50测定中的贴壁指示细胞染色效果好，能够提高病毒tcid50检测结果准确度的细胞染色剂，进一步提供该细胞染色剂的制备方法及应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供一种细胞染色剂，所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素3~8g/l，吉姆萨色素0.3~0.8g/l，亚甲基蓝0.3~0.8g/l，无水氯化钙10~15g/l，无水磷酸二氢钾3~8g/l，无水磷酸氢二钠0.3~0.8g/l，表面活性剂20~35ml/l，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（25~35）。
4、进一步优选地，所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素4~6g/l，吉姆萨色素0.4~0.6g/l，亚甲基蓝0.4~0.6g/l，无水氯化钙10~12g/l，无水磷酸二氢钾4~6g/l，无水磷酸氢二钠0.4~0.6g/l，表面活性剂20~30ml/l，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（30~35）。
5、进一步优选地，所述表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80、曲拉通x100或曲拉通x114中的一种或多种。
6、本专利技术第二方面提供一种上述细胞染色剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
7、（1）将所述瑞氏色素、吉姆萨色素、亚甲基蓝、无水氯化钙、无水磷酸二氢钾和无水磷酸氢二钠混合研磨成粉末，所述粉末过100目筛；
8、（2）将部分所述表面活性剂、部分二甲基亚砜、甘油和甲醇与所述粉末混合研磨5~15min，静置15~25min，移出上层液体；将下层沉淀与部分所述表面活性剂、部分二甲基亚砜、甘油和甲醇混合研磨5~15min，静置15~25min，移出上层液体，重复进行2~5次；合并上层液体并在室温下避光静置至少24小时，即得到所述细胞染色剂。
9、本专利技术第三方面提供上述细胞染色剂在贴壁细胞染色中的应用。
10、本专利技术第四方面提供上述细胞染色剂在病毒tcid50测定中的应用，采用所述细胞染色剂对病毒滴度tcid50测定中的指示细胞进行染色，所述指示细胞为贴壁细胞。
11、优选地，所述贴壁细胞为小鼠皮下结缔组织细胞（a9细胞）、非洲绿猴肾细胞（vero细胞）、中国仓鼠卵巢细胞（cho细胞）、小鼠胚胎成纤维细胞（nih-3t3细胞）、仓鼠肾成纤维细胞（bhk-21细胞）或小鼠皮肤成纤维细胞（穆氏邓恩细胞mus dunni细胞）。
12、本专利技术第五方面提供一种病毒tcid50测定中的指示细胞的染色方法，向由不含病毒的培养基培养的指示细胞和由含有病毒的培养基培养的指示细胞中加入上述细胞染色剂，室温静置染色8~12min，去除细胞染色剂，无菌水洗板，晾干，所述指示细胞在染色前不需要进行固定操作，所述指示细胞为贴壁细胞。
13、本专利技术第六方面提供一种病毒tcid50测定方法，所述病毒tcid50测定方法包括如下步骤：
14、（1）将指示细胞接种于细胞培养板的细胞培养孔中，采用dmem完全培养液培养至指示细胞铺板，所述指示细胞为贴壁细胞；
15、（2）采用dmem完全培养液将病毒原液进行梯度稀释得到不同稀释度的病毒稀释液，将步骤（1）的细胞培养孔中的培养基替换为病毒稀释液，继续培养6~8天，在培养3~5天时，将细胞培养孔中的病毒稀释液更换为dmem完全培养液；
16、（3）将步骤（2）的细胞培养孔中的dmem完全培养液替换为上述的细胞染色剂，室温静置染色8~12本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞染色剂，其特征在于：所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素3~8g/L，吉姆萨色素0.3~0.8g/L，亚甲基蓝0.3~0.8g/L，无水氯化钙10~15g/L，无水磷酸二氢钾3~8g/L，无水磷酸氢二钠0.3~0.8g/L，表面活性剂20~35mL/L，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（25~35）。
2.根据权利要求1所述的细胞染色剂，其特征在于：所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素4~6g/L，吉姆萨色素0.4~0.6g/L，亚甲基蓝0.4~0.6g/L，无水氯化钙10~12g/L，无水磷酸二氢钾4~6g/L，无水磷酸氢二钠0.4~0.6g/L，表面活性剂20~30mL/L，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（30~35）。
3.根据权利要求1所述的细胞染色剂，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80、曲拉通X100或曲拉通X114中的一种或多种。
4.一种如
5.一种如权利要求1至3中任一项所述的细胞染色剂在贴壁细胞染色中的应用。
6.一种如权利要求1至3中任一项所述的细胞染色剂在病毒TCID50测定中的应用，其特征在于：采用所述细胞染色剂对病毒滴度TCID50测定中的指示细胞进行染色，所述指示细胞为贴壁细胞。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述贴壁细胞为小鼠皮下结缔组织细胞、非洲绿猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、仓鼠肾成纤维细胞或小鼠皮肤成纤维细胞。
8.一种病毒TCID50测定中的指示细胞的染色方法，其特征在于：向由不含病毒的培养基培养的指示细胞和由含有病毒的培养基培养的指示细胞中加入权利要求1至3中任一项所述的细胞染色剂，室温静置染色8~12min，去除细胞染色剂，无菌水洗板，晾干，所述指示细胞在染色前不需要进行固定操作，所述指示细胞为贴壁细胞。
9.一种病毒TCID50测定方法，其特征在于：所述病毒TCID50测定方法包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的病毒TCID50测定方法，其特征在于：所述指示细胞为小鼠皮下结缔组织细胞、非洲绿猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、仓鼠肾成纤维细胞或小鼠皮肤成纤维细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞染色剂，其特征在于：所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素3~8g/l，吉姆萨色素0.3~0.8g/l，亚甲基蓝0.3~0.8g/l，无水氯化钙10~15g/l，无水磷酸二氢钾3~8g/l，无水磷酸氢二钠0.3~0.8g/l，表面活性剂20~35ml/l，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（25~35）。
2.根据权利要求1所述的细胞染色剂，其特征在于：所述细胞染色剂的原料组成包括：瑞氏色素4~6g/l，吉姆萨色素0.4~0.6g/l，亚甲基蓝0.4~0.6g/l，无水氯化钙10~12g/l，无水磷酸二氢钾4~6g/l，无水磷酸氢二钠0.4~0.6g/l，表面活性剂20~30ml/l，其余为溶剂，所述溶剂为二甲基亚砜、甘油和甲醇的组合物，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇的体积比为1：（1~5）：（30~35）。
3.根据权利要求1所述的细胞染色剂，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80、曲拉通x100或曲拉通x114中的一种或多种。
4.一种如权利要求1至3中任一项所述的细胞染色剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：周心怡，苏志浩，杨晓民，黄雨恬，张佳慧，汪涛，
申请(专利权)人：苏州良辰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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