【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株及其应用。
技术介绍
1、禽致病性大肠杆菌(apec)是危害家禽养殖业的重要细菌性病原，能够引起禽类呼吸道感染、败血症、多发性浆膜炎、肉芽肿、蜂窝组织炎、卵黄囊感染、脐炎和肿头综合征，统称禽大肠杆菌病。该病发病时间较快，发病率和死亡率较高，给养禽业造成了严重损失，对人类食品安全也构成了严重威胁。针对禽大肠杆菌病的防控以抗生素为主，随着抗生素的不合理使用及滥用，细菌出现了广泛耐药性，“禁抗”已成为畜禽养殖业不可阻挡的趋势。如何寻找抗生素替代品是细菌性疫病防控面临的重要问题。疫苗是预防疾病最有效的手段之一，疫苗的使用降低了疾病的危害程度。对于大肠杆菌的防控，疫苗也被认为是最佳手段。
2、细菌中的小rna(small rna，srna)是一类非编码rna(non-coding regulatoryrnas)，长度范围在50bp至500bp之间。它们在细菌的基因调控中发挥重要作用，尤其是在响应环境应激和调节病原性过程中。
3、细菌膜囊泡(membrane vesicles，mvs)是细菌在正常生长过程中产生的纳米膜结构，直径约为20～400nm。mvs含有来自细菌外膜的多种抗原蛋白，使其成为有效的候选疫苗。研究证实mvs可诱导针对细菌病原体的保护性免疫，包括脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌和百日咳博德特氏菌等。mvs的尺寸较小，使得它们能够进入淋巴管并被抗原呈递细胞(apc)摄取。此外，mvs具有天然佐剂特性，可强烈刺激先天免疫反应和适应性免疫反
4、然而目前研究显示apec的血清型较为复杂，因此生产针对不同血清型细菌具有交叉保护能力的疫苗至关重要。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株及其应用，缺失srna s053基因导致禽致病性大肠杆菌的脂多糖(lps)产量相对较低，该基因缺失株ce041δs053产生的膜囊泡(mvs)中lps含量较低，因此该缺失株制备的膜囊泡具有良好的免疫原性。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株，所述菌株为ce041δs053，其保藏编号为cctcc no：m 20232290，其分类命名为大肠杆菌escherichia coli ce041δs053，现保藏于中国典型培养物保藏中心。
4、上述禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株在制备亚单位疫苗中的应用。
5、优选地，所述疫苗为基于上述的禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株制备的膜囊泡亚单位疫苗、佐剂或免疫增强剂。
6、优选地，所述膜囊泡亚单位疫苗为广谱亚单位疫苗。
7、一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗，包括上述的禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株产生的膜囊泡。
8、一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
9、步骤1)配制菌液：将上述的禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株于lb固体培养基划线培养，挑取单菌落接种于lb液体培养基培养，至细菌数达到5.0×109cfu/ml；
10、步骤2)超速离心：将经步骤1)培养的禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失株ce041δs053加入500ml lb肉汤培养基中，37℃、180rpm培养12h；4℃、8000×g离心10min，弃掉沉淀，上清过滤除菌；然后将上清液以4℃、200000×g转速进行超速离心，离心3h后弃上清，将沉淀使用te缓冲液重悬；
11、步骤3)密度梯度离心：将步骤2)得到的悬浮液通过碘克沙醇密度梯度10％、20％、40％于4℃、200000×g离心分离2h；离心后收集分层液，再200000×g超速离心，用te缓冲液重悬沉淀，经过滤，浓缩，制得禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株ce041δs053的膜囊泡，于4℃保存；
12、步骤4)将步骤3)得到的膜囊泡与isa201 vg佐剂按1:1的体积比混合，使膜囊泡蛋白终浓度为2mg/ml，保存于-20℃，即得。
13、一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
14、步骤a)配制菌液：将权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株于lb固体培养基划线培养，挑取单菌落接种于lb液体培养基培养，至细菌数达到5.0×109cfu/ml；
15、步骤b)将经步骤a)培养的细菌转接至离心管中，于37℃、180rpm培养12h；4℃、8000×g离心10min，弃掉上清，沉淀经pbs重悬，置于冰上；
16、步骤c)将氮气空化装置置于冰上预冷，将经过预冷的氮气空化装置置于磁力搅拌器上，放入微型磁力搅拌棒，并与氮气罐连接；将步骤b)得到的细菌悬液转移至预冷的氮气空化装置中，开启搅拌器混匀悬液；逐步加压至压力表读数稳定在1500psi；关闭所有阀门，断开氮气罐，于冰上孵育25min，使氮气充分溶解并达到平衡状态；缓慢打开阀门释放压力，收集细菌裂解液；
17、步骤d)将步骤c)得到的细菌裂解液先经超速离心获得粗提囊泡，然后通过密度梯度离心获得纯化后的膜囊泡，即为禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株ce041δs053的膜囊泡，于4℃保存；
18、步骤e)将步骤d)得到的膜囊泡与isa201 vg佐剂按1:1的体积比混合，使膜囊泡蛋白终浓度为2mg/ml，保存于-20℃，即得。
19、优选地，步骤d)中，所述超速离心具体为：将步骤c)得到的细菌裂解液加入500mllb肉汤培养基中，37℃、180rpm培养12h；4℃、8000×g离心10min，弃掉沉淀，上清过滤除菌；然后将上清液以4℃、200000×g转速进行超速离心，离心3h后弃上清，将沉淀使用te缓冲液重悬，获得的悬浮液即为粗提囊泡；
20、所述密度梯度离心具体为：将粗提囊泡通过碘克沙醇密度梯度10％、20％、40％于4℃、200000×g离心分离2h；离心后收集分层液，再200000×g超速离心，用te缓冲液重悬沉淀，经过滤，浓缩，获得纯化后的膜囊泡。
21、一种禽致病性大肠杆菌广谱亚单位疫苗，包括上述的禽致病性大肠杆菌srnas053基因缺失菌株产生的膜囊泡。
22、本专利技术的有益效果如下：
23、本专利技术的禽致病性大肠杆菌srna s053基因缺失菌株ce041δs053遗传背景明确，传代后性状稳定，并且具有良好的生物安全性。该基因缺失菌株可以产生膜囊泡(mvs)，该mvs具有较好的免疫原性，通过氮气空化方法可以大量制备ce041δs053的mvs，可用于制备禽大肠杆菌病亚单位疫苗，免疫保护性较好，有助于预防禽致病性大肠杆菌感染。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种禽致病性大肠杆菌sRNA s053基因缺失菌株，其特征在于，所述菌株为CE041Δs053，其保藏编号为CCTCC NO：M 20232290，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coliCE041Δs053，现保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.权利要求1所述的一种禽致病性大肠杆菌sRNA s053基因缺失菌株在制备亚单位疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为基于权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌sRNA s053基因缺失菌株制备的膜囊泡亚单位疫苗、佐剂或免疫增强剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述膜囊泡亚单位疫苗为广谱亚单位疫苗。
5.一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌sRNA s053基因缺失菌株产生的膜囊泡。
6.权利要求5所述的一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.权利要求5所述的一种禽致病性大肠杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
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