【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，尤其涉及一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体及构建方法。
技术介绍
1、干细胞具有多向分化潜能，在再生医学研究领域备受关注。通过诱导干细胞向神经方向分化，使其修复或替代病损细胞及组织，为神经系统疾病的治疗提供了一种新的策略。然而，要实现这一治疗策略的临床应用，需要利用无创的影像学手段对干细胞分化过程进行有效的监测和评估。
2、目前用于干细胞监测的成像手段大致可分为三种，即光学成像、核医学成像和磁共振成像(mri)，其中mri因具有无辐射、组织穿透力强以及软组织对比度好等优点而被广泛应用。分子水平的mr成像研究常需借助于报告基因。目前mri报告基因可分为编码酶的报告基因、编码细胞膜受体的报告基因和内源性报告基因等几种。铁蛋白基因(ferritin)属内源性报告基因，是目前应用最为成熟和广泛的mri报告基因之一。
3、之前的研究中，我们已经利用fth1报告基因对干细胞神经分化过程进行了mri示踪研究，结果显示fth1能够在细胞内持续过表达并引起明确的聚铁效应，后者可产生明显的mri信号对比。这一mri示踪策略虽然实现了对干细胞分化前后的纵向监测，但显然不能有效区分分化后的神经细胞和分化前的干细胞，即无法明确干细胞神经分化这一事件发生的时间和空间信息。
技术实现思路
1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体及构建方法，利用gria23’utr对fth1报告基因进行改造，构
2、本专利技术采用的技术方案如下：一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，具体的，通过将fth1的3’utr替换为gria2的3’utr而构建的报告基因与慢病毒载体质粒gv367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒gv367-fth1-gria23’utr。
3、进一步地，所述将fth1的3’utr替换为gria2的3’utr构建的报告基因为fth1-gria23’utr，所述的fth1-gria23’utr核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、进一步地，所述fth1的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、进一步地，所述gria2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体的应用，包括所述的磁共振报告基因载体在检测神经分化mir-124动态变化中的应用；
7、进一步地，当细胞内mir-124表达增高时，特异性靶向结合于所述报告基因的gria23’utr，抑制所述报告基因的表达。
8、一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：
9、(1)双荧光素酶实验：验证mirna-124与所述报告基因3’utr结合情况。
10、(2)慢病毒载体构建：将人工合成的fth1序列和gria23’utr序列与载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒fth1-a3’utr，并对长出的单克隆进行测序；鉴定构建成功后感染293t细胞；48h后收集病毒液；离心得到病毒并标记为cmv-fth1-a3’utr；采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度，同时构建cmv-fth1作为阳性对照，cmv-nc空载病毒作为阴性对照；
11、(3)慢病毒转染细胞并筛选稳定株；
12、(4)诱导细胞分化，预期使得细胞分化后fth1表达较分化前下降；
13、(5)通过多种方法验证细胞分化前后fth1表达变化，并利用磁共振对分化前后的细胞进行扫描检测；
14、(6)预期实现该细胞分化前后，利用磁共振观察到信号改变，说明fth1表达，反应mirna-x在细胞分化过程中表达发生变化。
15、本专利技术有益效果如下：
16、(1)利用gria2的3’utr序列(gria23’utr)对fth1报告基因进行改造，构建mir-124反应性的fth1基因报告系统(fth1-gria23’utr)，利用慢病毒载体将该基因报告系统转导至小鼠p19干细胞，采用全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,atra)诱导法对转基因p19干细胞进行成神经诱导分化，并在分化前后行铁检测和mr成像，观察验证神经分化对报告基因表达的影响。
17、(2)将fth1的3’utr替换为gria2的3’utr，使mir-124通过与改造后的fth1的3’utr特异性结合，来控制fth1报告基因的表达；通过成神经分化前后细胞内报告基因表达的变化以及相应的聚铁效应改变(报告基因表达的变化反映了细胞内mir-124的含量)，从而通过mir-124的动态变化水平来间接判断干细胞分化事件的发生，实现mri对细胞内mir-124动态变化的可视化，从而有效监测干细胞分化事件，同时也为感兴趣mirna与待测目的基因的靶向关系研究提供一种无创的新型mri分子影像学手段。
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1.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，其特征在于，通过将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR而构建的报告基因与慢病毒载体质粒GV367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA23’UTR。
2.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR构建的报告基因为FTH1-GRIA23’UTR，所述的FTH1-GRIA23’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述FTH1的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述GRIA2的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的磁共振报告基因载体在检测神经分化miR-124动态变化中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：当细胞内miR-124表
7.根据权利要求1-4任一项所述的一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，其特征在于，通过将fth1的3’utr替换为gria2的3’utr而构建的报告基因与慢病毒载体质粒gv367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒gv367-fth1-gria23’utr。
2.一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述将fth1的3’utr替换为gria2的3’utr构建的报告基因为fth1-gria23’utr，所述的fth1-gria23’utr核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.一种监测mirna动态变化的磁共振报告基因载体，其...
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