【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、已知夜蛾或夜蛾科(noctuidae)有多种常见名称，包括地老虎(cutworm)、粘虫和飞蛾。夜蛾科涵盖1,000多个属和11,000多种。夜蛾科中有一些属和物种，每年造成大量的农作物破坏，造成数十亿美元的损失。包括灰翅夜蛾属(spodoptera)、铃夜蛾属(helicoverpa)、银灰夜蛾属(chrysodeixis)、大豆夜蛾属(anticarsia)、疆夜蛾属(peridroma)和实夜蛾属(heliothis)在内的几个属是造成全球农作物损失的主要昆虫。重要物种包括，例如，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)(草地夜蛾)、甜菜夜蛾(spodoptera exigua)(甜菜粘虫)、灰翅夜蛾(spodoptera littoralis)(非洲棉叶虫)、棉铃虫(helicoverpa armigera)(棉铃虫；螟蛉；古夜蛾；非洲棉铃虫)、疆夜蛾(peridromasaucia)(斑叶夜蛾)、谷实夜蛾(helicoverpa zea)(螟蛉；其他通用名称包括棉铃虫和番茄螟蛉)、银灰夜蛾(chrysodeixis includens)(大豆夜蛾)、梨豆夜蛾(anticarsiagemmatalis)(天鹅绒豆毛虫)(velvetbean caterpillar)和烟草夜蛾(heliothisvirescens)(烟草夜蛾幼虫)。
2、草地贪夜蛾例如影响多种农作物，包括玉米、水稻、棉花、甘蔗和高粱。雌性夜蛾每群约有2,000颗卵，每只夜蛾产下约1,000颗卵。从这些卵中孵出的
3、防治夜蛾科的尝试主要是通过使用农药。但是，昆虫对农药例如拟除虫菊酯、氨基甲酸酯和有机磷酸酯具有抗药性。控制昆虫的其他尝试包括使用转基因农作物，例如从苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)(bt作物)等微生物表达杀虫蛋白(例如cry1fa)的植物。但是，昆虫也对bt作物产生了抗性。
4、在本领域中非常需要开发一种解决方案，该解决方案以不同于现有作用方式的方式抑制夜蛾科种群，以减少对当前实践的依赖并由此减轻抗药性，并可能扭转杀虫剂在昆虫中的耐药性的趋势。
5、其中昆虫通过辐射绝育并释放以与相同物种的野生昆虫交配的昆虫不育技术(sit)在抑制昆虫种群方面是有效的(昆虫不育技术，dyck，vaj hendrichs，j.robinson，eds；springer netherlands，2005年)。这种sit方法的生物学替代方法是使用一种自限性基因，其中对昆虫进行遗传工程改造以使其包含可抑制的基因，这种基因在表达时会导致昆虫死亡。在自限性基因方法中，携带自限基因的雄性昆虫在相同物种的野生昆虫中被释放，后代继承自限性基因并且不能存活到成年。
6、自限性方法的最新发展利用了基因的性别特异性表达，并允许对其中仅雌性昆虫表达自限性基因的昆虫物种进行改造(wo 2007/091099)。当雄性自限性昆虫在野生种群中释放时，所有后代都继承自限性基因，但是由于性别特异性表达，只有雌性昆虫无法存活到成年。这种发展使得大量繁殖自限性雄性昆虫进行释放。在许多情况下，大规模的饲养和两性的物理分离是不切实际的，或者至少是劳动密集型的。
7、昆虫基因双性基因(dsx)已用于双翅目昆虫(dipteran)物种中以创建性别特异性剪接(wo 2018/029534)以及鳞翅目(lepidopteran)物种(jin，l.等(2013)acssynth.biol.2(3)：160-166；tan，a等(2013)proc.natl.acad.sci.usa 110(17)：6766-6770)。虽然双翅目昆虫dsx和鳞翅目昆虫dsx之间有一定的保守性，但看来鳞翅目昆虫中的性别特异性剪接机制不同于其他昆虫。双翅目、鞘翅目和膜翅目均通过tra/tra2复合体调节dsx mrna前体剪接，而鳞翅目似乎缺乏tra同源物，并使用不同的基因来针对dsx确定性别(nagaraju，j.等(2014)sex.devel.8(1-3)：104-12)。鳞翅目产生的雄性和雌性dsx蛋白同工型具有相同的n端区域，但蛋白质的c端部分不同，这是雄性和雌性dsx蛋白同工型具有不同性别特异性功能所必需的(suzuki，m.g.等(2005)evol.dev.7(1)：58-68；shukla，j.n.和j.nagaraju(2010)insect niochem.mol.biol.40(9)：672-682；xu,j.等(2017)insectbiochem.mol.biol.80：42-51)。
8、本领域中需要开发自限性的夜蛾科类，以抑制这些昆虫的种群，这些昆虫种群严重破坏了农作物并减少了世界的粮食供应。
技术实现思路
1、本专利技术提供用于指导节肢动物中编码功能蛋白的异源多核苷酸的性别特异性剪接的剪接盒(其中功能蛋白的编码序列限定在起始密码子和终止密码子之间)。所述盒包含夜蛾双性(dsx)基因的至少一个外显子2，或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个外显子3或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个外显子5或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个内含子2或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个内含子4或其部分；其中(a)所述异源多核苷酸的rna转录物的第一剪接产生第一剪接的mrna产物，其不具有从起始密码子延伸至终止密码子的连续开放阅读框；(b)所述rna转录物的可变剪接产生可变剪接的mrna产物，其包括从起始密码子延伸至终止密码子的连续开放阅读框。
2、在一些实施方式中，剪接盒包含夜蛾科双性(dsx)基因的至少一个外显子2或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个外显子3或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个外显子4或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个外显子5或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个内含子2或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个内含子3或其部分；夜蛾科dsx基因的至少一个内含子4或其部分；其中(a)所述异源多核苷酸的rna转录物的第一剪接产生第一剪接的mrna产物，所述第一剪接的mrna产物不具有从起始密码子延伸至终止密码子的连续开放阅读框；(b)所述rna转录物的可变剪接产生可变剪接的mrna产物，其包括从起始密码子延伸至终止密码子的连续开放阅读框。
3、在一些实施方式中，所述盒任选地包含夜蛾科dsx基因的至少一个外显子3a或其部分和/或夜蛾科dsx基因的至少一个外显子4b或其部分。
4、在一些实施方式中，编码功能蛋白的多核苷酸位于外显子2和外显子3的3'。在其他实施方式中，编码功能蛋白的多核苷酸位于外显子2、外显子3和外显子5的3'。在其他实施方式中，编码功能蛋白的多核苷酸位于外显子2、外显子3、外显子3a、外显子4、外显子4b和外显子5的3'。
5、在一些实施方式中，雄性中来自剪接盒的初级转录物被剪接，使得翻译终止于编码所述功能蛋白的多核苷酸的5'，并且功能蛋白不被翻译本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种减缓或逆转夜蛾科昆虫中对杀虫剂和/或生物杀虫剂的抗性的方法，其包括在相同物种的野生夜蛾科昆虫种群中释放包括表达系统的杀虫剂和/或生物杀虫剂易感的基因工程雄性夜蛾科昆虫，其中野生夜蛾科昆虫种群包含对杀虫剂具有抗性的多个昆虫，然后，经过基因改造的雄性夜蛾科昆虫与所述野生夜蛾科昆虫交配，雌性后代产生具有致死、有害或不育作用的功能蛋白，从而使易感性状渐渗入所述野生夜蛾科昆虫种群，抑制野生夜蛾科昆虫种群并稀释对杀虫剂具有抗性的野生夜蛾科昆虫种群，从而减缓或逆转所述野生夜蛾科昆虫种群对杀虫剂和/或生物杀虫剂的抗性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达系统包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其中，编码所述功能蛋白的所述多核苷酸编码Hid或其同源物、Reaper(Rpr)或其同源物、Nipp1Dm或其同源物、钙调蛋白或其同源物、Michelob-X或其同源物、tTAV或其同源物、tTAV2或其同源物、tTAV3或其同源物、tTAF或其同源物、medea或其同源物、microRNA毒素或核酸酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中编码所述功能蛋
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述功能蛋白包含SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶是FokI或EcoRI。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达系统进一步包含与编码所述功能蛋白的所述多核苷酸可操作连接的3′UTR或其部分。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达系统进一步包含编码功能蛋白的所述多核苷酸5'的泛素前导序列。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，编码所述功能蛋白的所述多核苷酸位于外显子2的3'，并且在外显子3内，使得编码所述功能蛋白的所述多核苷酸的侧翼为编码所述功能蛋白的所述多核苷酸5'的外显子3的第一部分，和编码所述功能蛋白的所述多核苷酸3'的外显子3的第二部分。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，编码功能蛋白的所述多核苷酸位于所述外显子2、外显子3、外显子3a、外显子4、外显子4b和外显子5的3'。
11.根据权利要求2所述的方法，其中在雄性中所述初级转录物被剪接，使得翻译终止于编码功能蛋白的所述多核苷酸的5′。
12.根据权利要求2所述的方法，其中在雄性中所述初级转录物被剪接，使得编码所述功能蛋白的多核苷酸从所述初级转录物中剪接下来。
13.根据权利要求1至8和10至12中任一项所述的方法，其中所述外显子3包含编码SEQID NO:72的氨基酸序列的多核苷酸。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一部分包含SEQ ID NO:94的多核苷酸序列，并且所述第二部分包含SEQ ID NO:9的多核苷酸序列。
15.根据权利要求1至8和10至12中任一项所述的方法，其中，所述外显子3包含SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
16.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子2包含编码SEQ ID NO:71的氨基酸序列的多核苷酸。
17.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子2包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:32的多核苷酸序列。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子3a包含编码SEQ ID NO:73的氨基酸序列的多核苷酸。
19.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子3a包含SEQ ID NO:12的多核苷酸序列。
20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子4包含编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的多核苷酸。
21.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
22.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4b-外显子4包含SEQ ID NO:90、SEQID NO:91或SEQ ID NO:92的多核苷酸序列。
23.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4b包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。
24.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子5包含编码SEQ ID NO:75的氨基酸序列的多核苷酸。
25.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子5包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列。
26.根...
【技术特征摘要】
1.一种减缓或逆转夜蛾科昆虫中对杀虫剂和/或生物杀虫剂的抗性的方法，其包括在相同物种的野生夜蛾科昆虫种群中释放包括表达系统的杀虫剂和/或生物杀虫剂易感的基因工程雄性夜蛾科昆虫，其中野生夜蛾科昆虫种群包含对杀虫剂具有抗性的多个昆虫，然后，经过基因改造的雄性夜蛾科昆虫与所述野生夜蛾科昆虫交配，雌性后代产生具有致死、有害或不育作用的功能蛋白，从而使易感性状渐渗入所述野生夜蛾科昆虫种群，抑制野生夜蛾科昆虫种群并稀释对杀虫剂具有抗性的野生夜蛾科昆虫种群，从而减缓或逆转所述野生夜蛾科昆虫种群对杀虫剂和/或生物杀虫剂的抗性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达系统包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其中，编码所述功能蛋白的所述多核苷酸编码hid或其同源物、reaper(rpr)或其同源物、nipp1dm或其同源物、钙调蛋白或其同源物、michelob-x或其同源物、ttav或其同源物、ttav2或其同源物、ttav3或其同源物、ttaf或其同源物、medea或其同源物、microrna毒素或核酸酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中编码所述功能蛋白的所述多核苷酸编码ttav或其同源物、ttav2或其同源物、ttav3或其同源物或ttaf或其同源物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述功能蛋白包含seq id no:80、seq id no:97或seq id no:98的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶是foki或ecori。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达系统进一步包含与编码所述功能蛋白的所述多核苷酸可操作连接的3′utr或其部分。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达系统进一步包含编码功能蛋白的所述多核苷酸5'的泛素前导序列。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，编码所述功能蛋白的所述多核苷酸位于外显子2的3'，并且在外显子3内，使得编码所述功能蛋白的所述多核苷酸的侧翼为编码所述功能蛋白的所述多核苷酸5'的外显子3的第一部分，和编码所述功能蛋白的所述多核苷酸3'的外显子3的第二部分。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，编码功能蛋白的所述多核苷酸位于所述外显子2、外显子3、外显子3a、外显子4、外显子4b和外显子5的3'。
11.根据权利要求2所述的方法，其中在雄性中所述初级转录物被剪接，使得翻译终止于编码功能蛋白的所述多核苷酸的5′。
12.根据权利要求2所述的方法，其中在雄性中所述初级转录物被剪接，使得编码所述功能蛋白的多核苷酸从所述初级转录物中剪接下来。
13.根据权利要求1至8和10至12中任一项所述的方法，其中所述外显子3包含编码seqid no:72的氨基酸序列的多核苷酸。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一部分包含seq id no:94的多核苷酸序列，并且所述第二部分包含seq id no:9的多核苷酸序列。
15.根据权利要求1至8和10至12中任一项所述的方法，其中，所述外显子3包含seq idno:94、seq id no:34或seq id no:56的多核苷酸序列。
16.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子2包含编码seq id no:71的氨基酸序列的多核苷酸。
17.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子2包含seq id no:7或seq id no:32的多核苷酸序列。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子3a包含编码seq id no:73的氨基酸序列的多核苷酸。
19.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子3a包含seq id no:12的多核苷酸序列。
20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外显子4包含编码seq id no:74的氨基酸序列的多核苷酸。
21.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4包含seq id no:15的多核苷酸序列。
22.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4b-外显子4包含seq id no:90、seqid no:91或seq id no:92的多核苷酸序列。
23.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子4b包含seq id no:14的多核苷酸序列。
24.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子5包含编码seq id no:75的氨基酸序列的多核苷酸。
25.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子5包含seq id no:17的多核苷酸序列。
26.根据权利要求2所述的方法，其中，所述内含子2包含seq id no:55的多核苷酸序列。
27.根据权利要求2所述的方法，其中所述内含子3包含seq id no:58的多核苷酸序列。
28.权利要求2所述的方法，其中所述内含子4包含seq id no:39的多核苷酸序列。
29.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子2包含编码seq id no:71的氨基酸序列的多核苷酸序列；所述外显子3包含编码seq id no:72的氨基酸序列的多核苷酸序列；所述外显子3a包含编码seq id no:73的氨基酸序列的多核苷酸序列；所述外显子4包含编码seq id no:74的氨基酸序列的多核苷酸序列；所述外显子5包含编码seq id no:75的氨基酸序列的多核苷酸序列。
30.根据权利要求2所述的方法，其中所述外显子2具有seq id no:7或seq id no:32的多核苷酸序列；所述外显子3的第一部分具有seq id no:94的序列的多核苷酸，第二部分具有seq id no:9的序列的多核苷酸；所述外显子3a具有se...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·乔伊斯，内森·罗斯，凯利·马岑，凯瑟琳·里夫，露西·布鲁姆，亚当·沃克，西蒙·沃纳，尼尔·莫里森，
申请(专利权)人：奥西泰克有限公司，
类型：发明
国别省市：
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