【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗氧化成分筛选，涉及一种从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法。
技术介绍
1、老年人易发生骨折，通常认为激素水平失衡、钙和维生素d缺乏以及正常衰老等原因导致骨质疏松、增加了骨脆性。最近的研究表明，氧化应激可能是导致骨质疏松症中成骨细胞和破骨细胞功能分离的罪魁祸首，因此探索和分析药用植物和中药的抗氧化活性成分，对揭示抗骨质疏松的物质基础非常重要。
2、无论是中药还是天然药物均含有多酚、黄酮类等化合物，其中不乏具有抗氧化作用的化合物，为防治骨质疏松症提供了潜在目标物，从中药中发现天然抗氧化成分也已成为一个重要的发展方向。然而，传统的发现抗氧化成分方法是通过繁琐的分离纯化、结构鉴定工作，并分别验证其活性，具有耗时长、成本高、过程复杂、难以全面反映中药的活性特征等不足；基于在线提取、筛选、鉴别和评价的抗氧化成分筛选技术，具有灵敏、快速、无需分离纯化等特点，能从复杂的中药成分中快速灵敏的筛选出抗氧化活性成分。前期文献检索发现，在中药复方及制剂的在线提取、筛选、鉴别和评价抗氧化活性成分研究相对较少。因此，研究新型中药抗氧化活性成分的快速发现及活性评价方法具有重要意义。
3、骨疏宁方是玉林市中西医结合骨科医院的院内制剂，来源于全国名老中医赖祥林教授的经验方，其主要成分为淫羊藿、枸杞子、肉苁蓉、菟丝子、仙茅、丹参、巴戟天、续断、杜仲、狗脊、骨碎补等，具有益阴助阳、补肾壮骨、养血化瘀、通络镇痛之功效。但是目前，对骨疏宁方的研究较少，不清楚抗氧化活性成分，同时也不清楚活性物质抗氧化活性的大小，不利于骨疏宁方抗氧
技术实现思路
1、针对上述研究背景，为了避免上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于公开提供一种从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，解决传统化学物质分离的方法过程复杂、耗时长、使用大量对环境不友好的化学试剂、分离成本高、效率低的问题，本专利技术方法测定过程中色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象，能够清晰、直观的检测出骨疏宁方中抗氧化成分的在线评价方法，为筛选药效指标成分及其质量评价提供一定的指导作用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，包括以下步骤：
3、(1)样品在线提取：称取骨疏宁方样品粉末与二氧化硅混合物，将混合物填充于在线提取池，并通过六通阀接入液相色谱系统，用流动相进行在线梯度提取；
4、(2)在线抗氧化分析：待测样品经hplc分离后，与abts溶液在peek管中进行反应、混合，再通过紫外检测器检测其抗氧化活性；
5、(3)抗氧化活性成分质谱检测：采用hplc-q-tof-ms对在线提取的样品溶液进行质谱检测。
6、所述步骤(1)中骨疏宁方样品粉末与二氧化硅混合物为4～8mg。
7、所述骨疏宁方样品粉末与二氧化硅之间的质量比为1:10～1:20
8、所述步骤(2)中，待测样品经hplc分离后，与p230ⅱ高压恒流泵泵出的abts溶液进行混合，并在1.0～3.0m×0.25μm的peek管中进行反应，再进入紫外检测器，在600～750nm波长下检测其抗氧化活性。
9、所述abts溶液的流速为0.3～0.6ml/min。
10、所述abts溶液的制备：称取abts和过硫酸钾适量，用水溶解，配制终浓度为含abts2.0～3.5mmol/l和过硫酸钾1.5～2.5mmol/l的水溶液，4℃避光反应12h。使用时用无水乙醇稀释，并调节abts溶液在紫外分光光度计上600～750nm处的吸收度为1.0。
11、所述步骤(3)中，esi电喷雾离子源，干燥气n2流速6～10l/min，干燥气体温度300～350℃，雾化压力30～40psig，毛细管电压3500v，扫描方式为正/负离子模式，碰撞诱导解离电压120v，离子扫描范围m/z 50～1000，分流比1:1。
12、所述步骤(3)中，色谱柱为thermo hypersil gold aq4.6 mm×150mm，5μm；柱温25℃；流动相为0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：0～15min，2％ b～12％ b；15～16min，12％b～14％b；16～19min，14％b；19～40min，14％～35％ b，流速1ml/min，检测波长280～300nm。
13、与现有技术相比，本公开的有益效果是：
14、(1)本专利技术采用在线提取、分析骨疏宁方中抗氧化物质，样品制备时间和提取溶剂消耗少，样品消耗仅为0.25mg。
15、(2)本专利技术采用的在线提取方法对极性成分和弱极性成分都表现出满意的提取效果。
16、(3)本专利技术采用的在线提取方法是一种整体提取方法，能让所有成分都在第一次提取中提取出来，体现了中药化学成分的整体性和特征性，适用于提取复杂样本中的整体成分。
17、(4)本方法只需观察两个检测器的色谱图，abts的色谱图是否有倒峰即可判断所测成分是否具有抗氧化作用，同时根据倒峰峰面积大小可比较不同成分抗氧化能力的强弱，可解决常用方法只能测定总提取物的抗氧化能力，不能测定单体的抗氧化能力的不足，具有操作简便、灵敏度精密度高而且稳定性好的特点。丹酚酸b在骨疏宁方中抗氧化能力最强。
18、(5)通过该方法从骨疏宁方中共筛选出19种具有抗氧化活性的成分，采用高效液相色谱-质谱联用鉴别出14种，为后续从复杂体系中较为全面的筛选抗氧化活性成分提供了新的研究思路和方法技术支持。
19、(6)本专利技术无须繁琐的分离纯化过程，可快速对骨疏宁方的抗氧化成分进行筛选和活性评价，色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象；具有同时评估的“谱-效”优点，为快速评价骨疏宁方提供了新的思路。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(1)中骨疏宁方样品粉末与二氧化硅混合物为4～8mg。
3.根据权利要求2所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述骨疏宁方样品粉末与二氧化硅之间的质量比为1:10～1:20。
4.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待测样品经HPLC分离后，与P230Ⅱ高压恒流泵泵出的ABTS溶液进行混合，并在1.0～3.0m×0.25μm的PEEK管中进行反应，再进入紫外检测器，在600～750nm波长下检测其抗氧化活性。
5.根据权利要求4所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述ABTS溶液的流速为0.3～0.6mL/min。
6.根据权利要求4或5所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述ABTS溶液的制备：称取ABTS和过硫酸钾适量，用水溶解，配制终浓度为含ABTS2
7.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，ESI电喷雾离子源，干燥气N2流速6～10L/min，干燥气体温度300～380℃，雾化压力30～40psig，毛细管电压3500V，扫描方式为正/负离子模式，碰撞诱导解离电压120V，离子扫描范围m/z:50～1000，分流比1:1。
8.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，色谱柱为Thermo Hypersil GOLD aQ 4.6mm×150mm，5μm；柱温25℃；流动相为0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：0～15min，2％B～12％B；15～16min，12％B～14％B；16～19min，14％B；19～40min，14％～35％B，流速1mL/min，检测波长280～300nm。
...【技术特征摘要】
1.一种从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(1)中骨疏宁方样品粉末与二氧化硅混合物为4～8mg。
3.根据权利要求2所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述骨疏宁方样品粉末与二氧化硅之间的质量比为1:10～1:20。
4.根据权利要求1所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待测样品经hplc分离后，与p230ⅱ高压恒流泵泵出的abts溶液进行混合，并在1.0～3.0m×0.25μm的peek管中进行反应，再进入紫外检测器，在600～750nm波长下检测其抗氧化活性。
5.根据权利要求4所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述abts溶液的流速为0.3～0.6ml/min。
6.根据权利要求4或5所述的从骨疏宁方中筛选抗氧化活性成分的方法，其特征在于，所述abts溶液的制备：称取abts和过硫酸钾适量，用水溶解，配制终浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：范卫锋，梁博伟，虞达欢，梁周，刘宇河，吴勇梅，何科，梁志敏，韦玉燕，梁考云，陈福瑶，
申请(专利权)人：玉林市中西医结合骨科医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。