【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的说是涉及一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法及应用。
技术介绍
1、犬乳腺肿瘤是母犬中最常见的肿瘤，发病初期会出现嗜睡，体重减轻，咳嗽，淋巴水肿等症状。研究发现，犬乳腺肿瘤的发病率高达40％，且易发于犬的腹部，尾部及腹股沟，发病年龄集中在7-12岁，同时患有乳腺肿瘤的犬中可能还会出现不同类型的肿瘤，其中50％是恶性的，且部分良性肿瘤有向恶性肿瘤发展的趋势。应用手术对病变部位切割是最保守的治疗方法，但手术治疗仅适用于肿块小，分化良好的肿瘤，对于具有侵袭性的恶性肿瘤，效果并不理想；化疗在临床上常以辅助治疗，但治疗过程中多伴有腹泻，呕吐，中性粒细胞减少等症状，甚至会导致病犬死亡。近年来，越来越多的研究人员开始聚焦犬乳腺肿瘤细胞，探讨抗肿瘤新药的作用效果和作用机制，为后期的体内研究提供理论基础。为保护正常细胞免受药物带来的毒性作用，应将药物应用于犬乳腺上皮细胞进行安全评价。原代乳腺上皮细胞直接来自动物新鲜组织或乳汁，分离的细胞适应体内到体外的环境变化后，恢复原有的增殖分裂能力，保留原有组织的特性，后续可用于药物的毒性研究以及探讨犬乳腺肿瘤发生发展的作用机制。
2、细胞的永生化是指体外培养的正常细胞自发或受到外界因素影响时，一部分细胞从增殖衰老的危机中逃离，从而具有无限增殖的能力。细胞自发发生永生化的几率非常小，一般借助特殊的方法获得永生化细胞。猴空泡病毒40(simian-virus 40，sv40)、人类疱疹病毒(epstein-barrvirus，ebv)和人乳头瘤病毒(humanpapill
3、因此，提供一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法及应用。
2、本专利技术采用乳汁分离法从健康泌乳的中华田园犬中分离出犬原代乳腺上皮细胞，并对其进行培养与鉴定，随后转染ef1α-sv40-ires-puromycin于原代犬乳腺上皮细胞，对其进行永生化改造，提高永生化犬乳腺上皮细胞的传代次数，降低培养成本，进一步为探索犬乳腺肿瘤的发生发展作用机制提供稳定的体外模型。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：
5、1)原代犬乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定；
6、将犬的乳头杀菌消毒，无菌条件下收集乳汁，分离犬原代乳腺上皮细胞并进行培养、鉴定；
7、2)构建永生化犬乳腺上皮细胞系
8、(1)培养原代犬乳腺上皮细胞，待原代犬乳腺上皮细胞稳定传代后，接种原代犬乳腺上皮细胞至6孔板继续培养24h后更换含猿猴病毒sv40的培养基；
9、(2)转染12h后加入含1μg/ml嘌呤霉素的上皮细胞完全培养基筛选永生化犬乳腺上皮细胞系；
10、(3)筛选48h后换液，并对存活细胞进行扩增。
11、进一步，步骤1)所述原代犬乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定具体步骤如下：
12、s1：选取泌乳期犬，并用无菌生理盐水冲洗乳头，洗净后使用75％酒精对乳头进行消毒，无菌条件下采集乳汁；将乳汁挤入15ml灭菌离心管中，放入37℃保温盒备用；
13、s2：将乳汁与含1％双抗的pbs混匀后，不断离心直至细胞悬液澄清，再次离心得到细胞沉淀(即为原代犬乳腺上皮细胞)；
14、s3：加入上皮细胞完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液均匀铺于t25细胞培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，含5％co2的培养箱中进行培养；
15、s4：取第2代生长完好的原代犬乳腺上皮细胞进行间接免疫荧光鉴定。
16、进一步，步骤(1)所述含猿猴病毒sv40的培养基包括1ml上皮细胞完全培养基与20μl ef1α-sv40-ires-puromycin。
17、进一步，所述的永生化犬乳腺上皮细胞系用于抗肿瘤药物的细胞模型。
18、进一步，所述的永生化犬乳腺上皮细胞系在药物安全性评价中的应用。
19、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法及应用，具有以下有益效果：
20、(1)本专利技术利用乳汁分离法成功分离原代犬乳腺上皮细胞，相比组织块贴壁法与胶原酶消化法，得到的乳腺上皮细胞的纯度高，细胞形态良好，增殖活性高，后续无需进行纯化步骤，节约了时间，减少了成本，提供了快速分离培养原代犬乳腺上皮细胞的方法；
21、(2)本专利技术构建的永生化犬乳腺上皮细胞系能够稳定传代，细胞形态符合上皮细胞特征，增殖速度快且没有出现衰老现象，解决了犬乳腺上皮细胞体外培养困难易衰老的问题；
22、(3)本专利技术建立的永生化犬乳腺上皮细胞系丰富了犬类细胞系的资源，且细胞系保留有原有组织特性，为抗肿瘤药物的挖掘提供合适的细胞模型；也可同犬乳腺肿瘤细胞进行对比研究，探讨抗肿瘤药物在犬乳腺肿瘤细胞的作用靶点，为后期了解犬乳腺癌的发生发展与药物对犬乳腺肿瘤的作用机制提供扎实基础。
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1.一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)所述原代犬乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述含猿猴病毒SV40的培养基包括1mL上皮细胞完全培养基与20μL EF1α-SV40-IRES-puromycin。
4.权利要求1-3中任一项所述的永生化犬乳腺上皮细胞系用于抗肿瘤药物的细胞模型。
5.权利要求1-3中任一项所述的永生化犬乳腺上皮细胞系在药物安全性评价中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)所述原代犬乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种永生化犬乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(...
【专利技术属性】
技术研发人员：张华，李宏全，冯子建，孙娜，孙盼盼，尹伟，范阔海，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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