【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用。
技术介绍
1、芽孢杆菌通常作为几种植物作物进行研究和商业化的植物促生长细菌。评估效果的主要难点是杆菌的种类，在检测时会受到相似种类的干扰，只能通过对其16s rrna的详细分析来识别基因或仅由物种内的其他基因。例如，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种密切相关的杆菌菌株可能是腐生的，或者是常见的植物促生长细菌，或者或两者均是。用一种植物促生长细菌定殖可能被其他物种的腐生根种类所掩盖。因此，实验室证明的成功菌株在接种失败后不能表明其作为植物促生长细菌在定殖能力方面的不足。这种遗传相关性杆菌在构建分子检测工具方面造成了重大困难，例如荧光原位杂交，现有eub338探针适用于多个杆菌种类，不能同时区分相近类别的杆菌。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种荧光原位杂交的组合物，所述组合物包括杂交探针、极性非质子溶剂、羧酸酰胺、溶菌酶、硫酸葡聚糖、异硫氰酸胍、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、以及ssc缓冲液；
3、所述杂交探针包括杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3，其中，杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的质量比例为1：(0.8～1.5)：(0.8～1.5)；
4、所述杂交探针1的序列为
5、5’-/fam/-c
6、所述杂交探针2的序列为5′-/novafluor blue 610-30sdye/tac cgc cct attcga acg gta c-3′；
7、所述杂交探针3的序列为5′-/cy3/gca gcc acc cgt agg tgt-3′；
8、所述极性非质子溶剂为内酯、砜或者碳酸酯；
9、所述极性非质子溶剂、羧酸酰胺、硫酸葡聚糖的体积比为(7～25)：(10～20)：(10～20)；
10、所述溶菌酶的浓度为5～15mg/ml，所述异硫氰酸胍的浓度为0.8～1.2mol/l；
11、所述组合物中各杂交探针的浓度均为0.8～1.5μmol/l；
12、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液的体积为极性非质子溶剂、羧酸酰胺和硫酸葡聚糖总体积的2～15倍。
13、上述荧光原位杂交的组合物通过杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的配合，可以同时检测区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。专利技术人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色的为枯草芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量基本一致的为蜡样芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量变化明显，且溶菌酶处理40～60分钟红色荧光点数量是溶菌酶处理15～25分钟红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。
14、优选地，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯、碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺；
15、优选地，所述组合物还包括二硫苏糖醇、ribolock rnase抑制剂、转移核糖核酸，所述异硫氰酸胍在组合物中的浓度为0.8～1.2mol/l；二硫苏糖醇在组合物中的浓度为8～15nmol/l，ribolock rnase抑制剂在组合物中的浓度为300～500u/ml，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/ml。
16、上述荧光原位杂交的组合物中，二硫苏糖醇作为巯基化dna的还原剂和去保护剂，可以降低dna的二聚化。
17、本专利技术还提供一种荧光原位杂交的组合物试剂盒，所述试剂盒包括杂交液、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、溶菌酶溶液、4％多聚甲醛以及5‰曲拉通；
18、溶菌酶溶液的浓度为8～12mg/ml，溶菌酶的溶剂为ph7.3～7.5的磷酸缓冲液；
19、所述杂交液中包括占所述杂交液体积5％～10％的ssc缓冲液、占所述杂交液体积10％～20％的甲酰胺、占所述杂交液体积7％～25％的极性非质子溶剂以及占所述杂交液体积10％～20％的硫酸葡聚糖，所述极性非质子溶剂为内酯、砜或者碳酸酯；
20、所述杂交液中还包括杂交探针、异硫氰酸胍、二硫苏糖醇、ribolock rnase抑制剂(ribolock rnase inhibitor)、转移核糖核酸(酵母trna)，所述杂交探针1的序列为5’-/fam/-cggcttcgctgccctttgttctgcccattgta-3’，所述杂交探针2的序列为5′-/novafluorblue 610-30sdye/tac cgc cct att cga acg gta c-3′，所述杂交探针3的序列为5′-/cy3/gca gcc acc cgt agg tgt-3′，各杂交探针在杂交液中的浓度为0.8～1.5μmol/l，异硫氰酸胍在杂交液中的浓度为0.8～1.2mol/l，二硫苏糖醇在杂交液中的浓度为8～15nmol/l，ribolock rnase抑制剂在杂交液中的浓度为300～500u/ml，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/ml。
21、上述荧光原位杂交的试剂盒通过杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的配合，可以同时检测区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。专利技术人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述组合物包括杂交探针、极性非质子溶剂、羧酸酰胺、溶菌酶、硫酸葡聚糖、异硫氰酸胍、pH7.3～7.5的磷酸缓冲液、以及SSC缓冲液；
2.根据权利要求1所述荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯、碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺。
3.根据权利要求1所述荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述组合物还包括二硫苏糖醇、Ribolock Rnase抑制剂、转移核糖核酸，所述异硫氰酸胍在组合物中的浓度为0.8～1.2moL/L；二硫苏糖醇在组合物中的浓度为8～15nmoL/L，Ribolock Rnase抑制剂在组合物中的浓度为300～500U/mL，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/mL。
4.一种荧光原位杂交的组合物试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交液、pH7.3～7.5的磷酸缓冲液、溶菌酶溶液、4％多聚甲醛以及5‰曲拉通；
5.根据权利要求4所述荧光原位杂交的组合物试剂盒，其特征在于，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯或碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺
6.如权利要求1-3任一所述荧光原位杂交的组合物在原位杂交检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的应用。
7.如权利要求4～5任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒在原位杂交检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的应用。
8.一种利用如权利要求4～5任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒同时检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的原位杂交检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述同时检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的原位杂交检测方法，其特征在于，所述步骤(8)中，荧光显绿色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色的为枯草芽孢杆菌，在B样中的红色荧光点数量为A样中红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。
...【技术特征摘要】
1.一种荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述组合物包括杂交探针、极性非质子溶剂、羧酸酰胺、溶菌酶、硫酸葡聚糖、异硫氰酸胍、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、以及ssc缓冲液；
2.根据权利要求1所述荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯、碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺。
3.根据权利要求1所述荧光原位杂交的组合物，其特征在于，所述组合物还包括二硫苏糖醇、ribolock rnase抑制剂、转移核糖核酸，所述异硫氰酸胍在组合物中的浓度为0.8～1.2mol/l；二硫苏糖醇在组合物中的浓度为8～15nmol/l，ribolock rnase抑制剂在组合物中的浓度为300～500u/ml，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/ml。
4.一种荧光原位杂交的组合物试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交液、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、溶菌酶溶液、4％多聚甲醛以及5‰曲拉通；
5.根据权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：周璇，张马辉，刘淼，李松玉，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：
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