【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及利用大肠杆菌表达h9亚型禽流感病毒ha重组蛋白，利用蛋白耦合技术进行重组蛋白的连接以制备具有良好免疫保护作用的免疫原。
技术介绍
1、
2、传统基于鸡胚的流感病毒全病毒灭活疫苗生产方法在应对流行毒株或潜在大流行毒株的需求方面，需要对临床变异毒株进行抗原性鉴定和筛选，再进行病毒的分离和纯化，这一过程限制了鸡胚疫苗对于新流行株的响应速率，存在产能不足，生产速度不够，成本高；含有病原体全部组分可能引起过敏反应或其他副反应；全病毒免疫组分多，针对免疫有效组分的有效免疫记忆弱；全病毒疫苗的免疫压力下更容易造成病毒出现免疫逃逸现象；全病毒疫苗免疫影响监测方法的建立等问题。在人类流感防控中，人们已提出用哺乳动物细胞或昆虫细胞生产病毒蛋白制备大流行和季节性流感疫苗的策略，但外源蛋白在细胞中表达水平较低并不是太适用于禽用疫苗。相对而言，利用细菌表达保护性蛋白更简单且迅速。大肠杆菌(escherichia coli)表达系统作为生物
中的常见蛋白表达系统，具有快速、高效、表达水平高、成本低、可扩展性强、遗传改造简单和纯化便捷等优势。
3、流感病毒的ha蛋白分别由抗原性高度变异的头部球状结构域ha1和保守的茎部结构域ha2组成。当使用全病毒灭活疫苗或整个ha蛋白进行免疫时，所诱导的抗体主要针对免疫优势区域中的ha1部分表位。因此，一旦抗原发生变异，传统疫苗的有效性就会受到影响。相较于ha1结构域，ha2通常更为保守，因此针对ha2茎部结构域的抗体能够中和多种不同亚型的流感毒株。然而完整ha分子
4、不同蛋白质之间的组装融合在生物转化、疫苗研发、诊断和治疗等领域具有巨大的潜力。将多个蛋白质的编码dna放置于单一开放阅读框架内相对简单，但如此串联表达可能会导致蛋白翻译和折叠出现错误。因此，将蛋白质模块化地单独表达，再进行耦合，已成为拓展蛋白质功能的关键工具。随着生物工程技术的不断发展以及对生物酶的深入研究，一些生物酶介导的偶联方法展现出条件温和、位点特异性连接以及产物稳定和均质等优势。但现有技术中的耦合方法得到的重组蛋白同时存在连接效率低、保护效力低等问题，亟需提供一种高效便捷的重组蛋白以制备广谱的h9亚型广谱亚单位疫苗。
技术实现思路
1、通过对h9n2亚型禽流感病毒的ha1和ha2的相互作用结构域进行筛选，应用rosetta-design进行结构的进一步优化计算，并在大肠杆菌中表达了h9n2的ha6蛋白。通过表达snoopligase、snooptagjr-egfp和imx-dogtag以探索snoopligase催化耦合体系反应条件及效率；通过蛋白固定化，探索了snoopligase连接后纯化方法；将ha6与ha1进行连接后纯化，并评估其作为免疫原是否能够有效保护鸡免受h9n2亚型禽流感病毒的感染。
2、本专利技术提供一种利用snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒多蛋白嵌合亚单位疫苗的制备及应用，主要目的是开发一种利用大肠杆菌表达并可灵活组合的h9n2亚型禽流感亚单位疫苗。
3、为实现本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案是：
4、一种基于snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒ha重组蛋白，采用ha1和ha6分别添加snooptagjr和dogtag，得到ha1-snooptagjr和dogtag-ha6，再将ha1-snooptagjr和dogtag-ha6耦合连接；ha1-snooptagjr的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述dogtag-ha6的氨基酸序列如seq id no.3所示。。
5、进一步的，编码ha1-snooptagjr的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码dogtag-ha6的核苷酸序列如seq id no.4所示。。
6、ha1-snooptagjr氨基酸序列：
7、dkicigyqstnstetvdtltennvpvthakellhtehngmlcatglghplildtctiegliygnpscdlllggrewsyiverpsavnglcypgnvenleelrslfssassyqriqifpdtiwnvtysgtskacsdsfyrsmrwltqknnaypiqdaqytnnqeknilfmwginhpptdtaqtnlytrtdtttsvateeinrtfkpligprplvnglqgridyywsvlkpgqtlrirsngnliapwyghilsgeshgrilktdlkrgsctvqcqtekgglnttlpfqnvskyafgncskyigikslklavglrnvpsrssrgsgsgegsgklgsiefikvnk(seq id no.1)
8、ha1-snooptagjr核酸序列：
9、gacaaaatctgcatcggctatcaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaa
10、acaatgtccctgtgacacatgccaaagaattgctccacacagagcataatgggatgctgtgtgc
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20、ccaatggaaatctaatagctccat本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白，其特征在于，采用HA1和HA6分别添加SnoopTagjr和DogTag，得到HA1-SnoopTagjr和DogTag-HA6，再将HA1-SnoopTagjr和DogTag-HA6耦合连接；HA1-SnoopTagjr的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DogTag-HA6的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白，其特征在于，编码HA1-SnoopTagjr的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码DogTag-HA6的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。。
3.根据权利要求1所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白的构建方法，其特征在于，利用Snoopligase蛋白耦合系统，将HA6免疫原与HA1进行耦合，获得重组蛋白HA1-HA6。
4.根据权利要求3所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流
5.根据权利要求3所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白的构建方法，其特征在于，利用TX株为模版，进行HA1序列的扩增，再利用重叠延伸PCR的方法，分别在HA6 N端添加DogTag和在HA1 C端添加SnoopTagjr，再将DogTag-HA6连接至pET-28a，将HA1-SnoopTagjr连接至pET-32a，引物如下：
6.根据权利要求3所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白的构建方法，其特征在于，耦合条件为：pH 6.0-8.5，甘油含量30-40％，反应时间为13h，底物浓度为15μM，Snoopligase浓度为30μM。
7.权利要求1所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白在制备检测H9N2亚型禽流感病毒感染或H9N2亚型禽流感病毒抗体检测试剂或试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白在制备防治H9N2亚型禽流感病毒感染的药物中的应用。
9.权利要求1所述的基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白在制备H9N2亚型禽流感病毒疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，权利要求1所述基于Snoopligase耦合系统的H9N2亚型禽流感病毒HA重组蛋白用于提高IL-2和IL-4的转录水平，及INF-γ的表达水平。
...【技术特征摘要】
1.一种基于snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒ha重组蛋白，其特征在于，采用ha1和ha6分别添加snooptagjr和dogtag，得到ha1-snooptagjr和dogtag-ha6，再将ha1-snooptagjr和dogtag-ha6耦合连接；ha1-snooptagjr的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述dogtag-ha6的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.如权利要求1所述的基于snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒ha重组蛋白，其特征在于，编码ha1-snooptagjr的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码dogtag-ha6的核苷酸序列如seq id no.4所示。。
3.根据权利要求1所述的基于snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒ha重组蛋白的构建方法，其特征在于，利用snoopligase蛋白耦合系统，将ha6免疫原与ha1进行耦合，获得重组蛋白ha1-ha6。
4.根据权利要求3所述的基于snoopligase耦合系统的h9n2亚型禽流感病毒ha重组蛋白的构建方法，其特征在于，以pegfp-c1为模板扩增egpf序列并通过重叠延伸pcr添加snooptagjr标签；将上述基因片段插入pet-28a质粒进行表达，引物序列如下：
5.根据权利要求3所述的基于snoopligase耦合系统的h9n2...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈素娟，全柯吉，彭大新，秦涛，印云聪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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