【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞外囊泡分离，具体涉及一种聚乙二醇水凝胶整体柱，以及采用聚乙二醇水凝胶整体柱和二氧化硅尺寸排阻分离柱联用分离纯化细胞外囊泡的方法。
技术介绍
1、细胞外囊泡具有典型的磷脂双分子层膜结构，由所有的真核细胞和大多数已知的古生菌和细菌分泌，直径分布在50～200nm。囊泡结构及其纳米粒径使其可以运送源细胞内各种生物信息分子如蛋白质、核酸和脂质，而不被体液中的酶降解，承担细胞间信号传递的信使、货物运输的载体等多种功能。
2、细胞外囊泡的分离原理主要基于其理化特征，如超速离心法在一定的离心力下，通过密度、大小的不同分离样品中的不同组分，是细胞外囊泡分离方法的“黄金标准”。但这种方法由于耗时长，需要专用的超离心设备，限制了其在临床中的应用。并且分离所得细胞外囊泡的结构和生物学功能可能会受到长时间的超离心力的影响。聚合物沉淀法是许多商用提取试剂盒的基础，高度亲水的聚合物与细胞外囊泡周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导致细胞外囊泡沉淀。虽然回收率可能很高，但析出的细胞外囊泡样品的纯度较低，因其基本上析出了所有可溶颗粒。并且沉淀试剂不能从最终的制剂中完全除去，会潜在地影响下游的表征或分析。与分离方法相比，更像是一种浓缩方式。超滤法使用具有不同分子量截止值的纳米过滤膜从临床样品中富集分离细胞外囊泡，并通过大小区分细胞外囊泡和非细胞外囊泡。但在过滤过程中，其剪切应力会引起潜在劣化，并且可能由于膜堵塞而造成一定损失。尺寸排阻色谱法能够以最小的结构损伤分离细胞外囊泡。早在应用于细胞外囊泡的分离纯化之前，尺寸排阻色谱法就已
3、上述分离方法在不同程度上存在着细胞外囊泡完整性不足、纯度低、费时并且需要昂贵仪器的问题。因此，如何实现细胞外囊泡高产量高纯度的制备并满足临床需求是亟需研究的方向之一。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于实现细胞外囊泡高产量高纯度的分离富集，并解决大批量纯化细胞外囊泡时费时费力，需昂贵离心设备，或沉淀制剂对下游分析的影响等问题，提供了一种聚乙二醇水凝胶整体柱，以及采用该整体柱与二氧化硅尺寸排阻分离柱联用批量分离纯化细胞外囊泡的方法，用于从大批量生物样本中分离富集细胞外囊泡。
2、为达到上述目的，本专利技术提供的聚乙二醇水凝胶整体柱由下述步骤制备得到：
3、步骤1：在1×磷酸盐缓冲溶液中加入聚乙二醇单甲醚与聚乙二醇二丙烯酸酯，预混合后用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph为7～8，再加入四甲基乙二胺、硫酸铵和丙烯，得到聚乙二醇聚合溶液；
4、步骤2：取层析空柱，盖好底帽之后，加入聚乙二醇聚合溶液，聚乙二醇聚合溶液的加入量为柱体积的5％～20％，然后将柱子放置于-20℃中聚合反应12～24小时；反应结束后放至柱子恢复常温，取下底帽，用去离子水清洗柱内凝胶，得到聚乙二醇水凝胶整体柱。
5、上述步骤1中，优选所述聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二丙烯酸酯、四甲基乙二胺、丙烯的加入量依次为聚乙二醇聚合溶液体积的8％～12％、0.1％～0.3％、0.1％～0.3％、0.8％～1.5％，所述硫酸铵的加入质量与聚乙二醇聚合溶液的体积比为3～5mg:100ml。
6、本专利技术提供的批量分离纯化细胞外囊泡的方法包括下述步骤：
7、步骤1：将生物样本加入权利要求1或2所述的聚乙二醇水凝胶整体柱中，上样体积与柱床体积比为20:1～5:1。常温反应30～120分钟后，压缩柱中聚乙二醇水凝胶，收集流出液，即得到浓缩后生物样本；
8、步骤2：将浓缩后生物样本加入二氧化硅尺寸排阻分离柱中，上样体积与柱床体积比为1:10～1:50，待浓缩后生物样本流入柱床之中，再加入10mmol/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗脱，洗脱所用缓冲液与上样体积比为20:1～40:1；收集流出液体积达到缓冲液体积30％～40％的部分，即得到细胞外囊泡。
9、上述批量分离纯化细胞外囊泡的步骤1中，优选上样体积与柱床体积比为10:1～15:1。
10、上述批量分离纯化细胞外囊泡的步骤1中，所述聚乙二醇水凝胶整体柱使用完后进行再生，再生方法为：用去离子水清洗后干燥即可。
11、上述批量分离纯化细胞外囊泡的步骤2中，所述二氧化硅尺寸排阻分离柱的制备方法为：将粒径为30～90μm、孔径为50～100nm的硅胶加入去离子水中混合混匀，获得硅胶分散液；在盖好底帽的层析空柱中安装好孔径为10～20μm的下筛板后加入硅胶分散液，自然沉降24小时以上使下部沉淀达到所需柱高，吸去上部溶液，然后安装好孔径为10～20μm的上筛板，即得到二氧化硅尺寸排阻分离柱。
12、上述批量分离纯化细胞外囊泡的步骤2中，优选上样体积与柱床体积比为1:20～1:30。
13、上述批量分离纯化细胞外囊泡的步骤2中，所述二氧化硅尺寸排阻分离柱使用完后进行再生，再生条件为：先用2～4倍柱床体积的体积浓度为1％曲拉通水溶液清洗，之后用2～4倍柱体积的去离子水清洗，再用2～4倍柱床体积的体积浓度为70％的乙醇水溶液清洗，然后用2～4倍柱床体积的去离子水清洗；若二氧化硅尺寸排阻分离柱连续使用，再用2～4倍柱床体积的10mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液清洗，若二氧化硅尺寸排阻分离柱长期保存则置于体积浓度为20％的乙醇水溶液中。
14、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
15、1、本专利技术的聚乙二醇水凝胶整体柱可实现简便高效的大体积生物样本的浓缩，相较于聚合物沉淀法无额外试剂添加，与超滤法相比无需昂贵设备仪器，并且避免了超滤膜的堵塞所造成的细胞外囊泡损失以及对其完整性的破坏，节约时间以及实验成本的同时实现高产量的需求。且其合成方法简便易普及，聚乙二醇生物相容性好、安全无毒，不会对生物样本造成污染。
16、2、本专利技术所将浓缩后生物样本使用二氧化硅尺寸排阻分离柱除去杂质蛋白，实现高纯度的要求。采用的二氧化硅尺寸排阻分离柱的填料粒径、孔径更均一，粒径适用于细胞外囊泡的分离纯化。与现有商用琼脂糖、葡聚糖类生物基填料相比刚性更好，不易坍塌，适应高流速高被压的分离环境，分辨率更高，并且可重复使用次数更高。
17、3、本专利技术结合浓缩与纯化两种方法，同时满足了对细胞外囊泡分离时的产量和纯度的要求，方法简便易实施并且经济绿色，为后续批量纯化细胞外囊泡提供了一种可行的方案。
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1.一种聚乙二醇水凝胶整体柱，其特征在于所述整体柱由下述步骤制备得到：
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇水凝胶整体柱，其特征在于：步骤1中，所述聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二丙烯酸酯、四甲基乙二胺、丙烯的加入量依次为聚乙二醇聚合溶液体积的8％～12％、0.1％～0.3％、0.1％～0.3％、0.8％～1.5％，所述硫酸铵的加入质量与聚乙二醇聚合溶液的体积比为3～5mg:100mL。
3.一种批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
4.根据权利要求3所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，上样体积与柱床体积比为10:1～15:1。
5.根据权利要求3或4所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，所述聚乙二醇水凝胶整体柱使用完后进行再生，再生方法为：用去离子水清洗后干燥即可。
6.根据权利要求3所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤2中，将粒径为30～90μm、孔径为50～100nm的硅胶加入去离子水中混合混匀，获得硅胶分散液；在盖好底帽的层析空柱中安装好
7.根据权利要求3所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤2中，上样体积与柱床体积比为1:20～1:30。
8.根据权利要求3、6、7任意一项所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤2中，所述二氧化硅尺寸排阻分离柱使用完后进行再生，再生条件为：先用2～4倍柱床体积的体积浓度为1％曲拉通水溶液清洗，之后用2～4倍柱体积的去离子水清洗，再用2～4倍柱床体积的体积浓度为70％的乙醇水溶液清洗，然后用2～4倍柱床体积的去离子水清洗；若二氧化硅尺寸排阻分离柱连续使用，再用2～4倍柱床体积的10mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液清洗，若二氧化硅尺寸排阻分离柱长期保存则置于体积浓度为20％的乙醇水溶液中。
...【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇水凝胶整体柱，其特征在于所述整体柱由下述步骤制备得到：
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇水凝胶整体柱，其特征在于：步骤1中，所述聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二丙烯酸酯、四甲基乙二胺、丙烯的加入量依次为聚乙二醇聚合溶液体积的8％～12％、0.1％～0.3％、0.1％～0.3％、0.8％～1.5％，所述硫酸铵的加入质量与聚乙二醇聚合溶液的体积比为3～5mg:100ml。
3.一种批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
4.根据权利要求3所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，上样体积与柱床体积比为10:1～15:1。
5.根据权利要求3或4所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤1中，所述聚乙二醇水凝胶整体柱使用完后进行再生，再生方法为：用去离子水清洗后干燥即可。
6.根据权利要求3所述的批量分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，步骤2中，将粒径为30～90μm、孔径为50～10...
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