【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及辅助生殖领域，具体涉及的是一种用于冷冻胚胎的产品及其应用。
技术介绍
1、胚胎冷冻技术是体外受精胚胎移植的衍生技术，因为在做试管婴儿的过程中，需要促使多个卵泡发育，从而获得多个卵子，使最终得到的胚胎会有几个或者十几个，甚至更多。胚胎移植一般都会有选择性移植1-2枚胚胎，移植以后剩余的胚胎在冷冻技术发展以前要全部丢弃，因此造成了胚胎资源的极大浪费，即一旦患者没有怀孕，就需要重新开始新一轮的促排卵、取卵等过程。
2、冷冻胚胎是保存生育功能的唯一成熟方法。冷冻胚胎的技术是将通过试管培育技术得到的胚胎，存置于零下196℃的液氮环境中，得到长时间保存。如果这个周期治疗失败，可以在以后的自然周期中解冻这些胚胎并进行移植。利用这种技术，细胞的生物活性可以被抑制，在生理温度下将细胞解冻后，细胞的功能也可以恢复。目前应用最广泛的胚胎冷冻技术为快速冷冻又称为玻璃化的无冰冷冻工艺，依赖高浓度的冷冻保护剂和添加剂，使细胞快速脱水，以减少冰结晶的形成，并将冷冻胚胎直接放入液氮中迅速降温冷冻。但是，胚胎细胞相较于其他细胞对环境更为敏感，突然接触达到高浓度的冷冻保护剂，胚胎回暖收到一定的损伤。而且，传统的方法冻存的胚胎储存在冻存管中会有胚胎丢失的风险。
3、由于胚胎细胞比普通细胞更为脆弱和珍贵，在冻存过程中，利用程序化降温的方法容易导致细胞内产生冰晶，对细胞造成伤害；而采用玻璃化急速降温，需要添加高浓度渗透性冷冻保护液则会造成脂肪间充质干细胞中毒。目前胚胎冷冻效果最好的方式为玻璃化冷冻，复苏后胚胎的存活率为80％左右。除
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种用于冷冻胚胎的产品及其应用，本专利技术通过凝胶包被和微流控冷冻的方法冻存胚胎，胚胎储存在芯片中冷冻保存，大大降低了胚胎丢失的风险；在胚胎包封中，水凝胶具有独特的三维网状结构，其有利于在低温保存过程中最大限度地减少细胞损伤，可以将冰晶生长限制在其三维网络中；本专利技术能够抑制冰核形成、限制冰晶生长、降低细胞损伤、提高胚胎的复苏率。
2、本专利技术首先提供了一种用于冷冻胚胎的产品，其包括芯片、用于制备胚胎凝胶微球的材料和冷冻液；
3、所述芯片包括底片和载片，所述底片用于支撑载片；
4、所述载片上设置流入口、蛇形通道、胚胎室、阻挡区和出口；
5、其中，所述流入口为4个，分别为流入口1、流入口2、流入口3和流入口4；所述流入口3连接两条微流道和所述流入口4的微流道交汇形成一条微流道a；所述流入口2连接两条微流道和所述微流道a交汇形成一条微流道b；所述流入口1连接两条微流道和所述微流道b交汇形成一条微流道，该微流道依次连接所述蛇形通道、胚胎室、阻挡区和出口；
6、所述用于制备胚胎凝胶微球的材料包括海藻酸钠、培养基、含钙离子的交联剂、表面活性剂、1h,1h,2h,2h-全氟-1-辛醇、水和有机溶剂；
7、所述冷冻液包括如下组分：1)乙二醇；2)蔗糖或海藻糖；3)聚蔗糖；4)含有胎牛血清(fbs)的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液或含有胎牛血清的胚胎培养基。
8、上述的产品中，所述蛇形通道的宽度为50～400μm，设置有3～20个弯折，具体可为18；弯折角度为90°～180°，具体可为180°；设置的蛇形通道使得多个溶液能够在通道内充分混合；所述蛇形通道的宽度具体可为100μm或300μm；
9、所述胚胎室的空间至少容纳1个胚胎细胞，其直径为1～5mm，具体可为2.5mm；
10、所述胚胎室具有如下任一种设置：
11、1)所述胚胎室设置直径100μm半圆小室，可以储存胚胎；半圆小室是通过在胚胎室中设置阻挡柱形成的；
12、2)所述胚胎室设置直径200μm凹陷半圆小室，可以储存胚胎；
13、所述阻挡区的微流道宽度小于25μm，使得胚胎不会随微通道中的液体从胚胎室移动到出口；具体的，所述阻隔区中设置2～4排阻挡柱使得微通道宽度小于25μm或者直接设置阻挡区的微流道宽度小于25μm；具体可为小于等于20μm；
14、所述胚胎室的上方设有1～3mm圆形开口，用于放入和取出胚胎细胞；
15、所述芯片的微通道高度均为50～400μm，能容纳不同大小的胚胎细胞通过；优选为100μm或300μm；
16、所述载片为对细胞无毒害的耐低温透明材质，具体可为聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚丙烯(pp)和耐低温玻璃等中的任一种。
17、上述的产品，所述流入口2所连接的微流道宽度为50μm；所述流入口1、3和4所连接的微流道宽度为100～300μm；
18、所述流入口直径均为1.5～2mm。
19、上述的产品，所述流入口3连接两条微流道和流入口4的微流道所连形成的夹角为60°；所述流入口2连接两条微流道和微流道a所连形成的夹角为60°；所述流入口1连接两条微流道和微流道b所连形成夹角为60°。
20、上述的产品，所述冷冻液中，所述乙二醇的体积百分浓度为15～40％；所述蔗糖或海藻糖的浓度为0.2～0.8mol/l；所述聚蔗糖的浓度为0.01～1mg/ml；余量为含有胎牛血清的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液或含有胎牛血清的胚胎培养基；
21、具体的，所述冷冻液中，所述乙二醇的体积百分浓度为20％；所述蔗糖或海藻糖的浓度为0.5mol/l；所述聚蔗糖的浓度为0.5mg/ml；所述聚蔗糖的分子量为40000；
22、所述含有胎牛血清的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液或含有胎牛血清的胚胎培养基中，所述胎牛血清的体积百分浓度为10～40％，具体可为20％。
23、上述的产品中，所述含钙离子的交联剂为氯化钙、nta-ca或者edta-ca；
24、所述表面活性剂为含氟表面活性剂、失山梨醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯中的至少一种；
25、所述有机溶剂为氟化油、石蜡油和豆油中的至少一种。
26、本专利技术还提供了上述产品在用于冷冻保存胚胎中的应用。
27、最后，本专利技术提供了一种冷冻保存胚胎的方法，包括如下步骤：
28、(1)采用所述芯片将用于制备胚胎凝胶微球的材料和胚胎制备成胚胎凝胶微球，所述胚胎凝胶微球在所述胚胎室聚集；
29、(2)当所有胚胎凝胶微球都聚集到胚胎室中时，将所述流入口1、流入口2和流入口4封住，从所述流入口3通入hepes缓冲液或培养基将氟化油从芯片中排出；
30、(3)将所述冷冻液从流入口4通入，调节其流速1～10min内从0μl/min线性增加到20～50μl/min；同时调节所述流入口3中液体流速从20～50μl/min线性降低到0μl/min；通道内的总流速不变；
31、(4)冷冻液加载完毕后，将所述芯片投入到液氮中冷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于冷冻胚胎的产品，其包括芯片、用于制备胚胎凝胶微球的材料和冷冻液；
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于：所述蛇形通道的宽度为50～400μm，设置有3～20个弯折，弯折角度为90°～180°；
3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：所述冷冻液中，所述乙二醇的体积百分浓度为15～40％；所述蔗糖或海藻糖的浓度为0.2～0.8mol/L；所述聚蔗糖的浓度为0.01～1mg/mL；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的产品，其特征在于：所述含钙离子的交联剂为氯化钙、NTA-Ca或者EDTA-Ca；
5.权利要求1-4中任一项所述的产品在用于冷冻保存胚胎中的应用。
6.一种冷冻保存胚胎的方法，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，制备胚胎凝胶微球的方法如下：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述混合液1中，所述海藻酸钠的浓度为2～10mg/mL；
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述混合液1的流速为5～700μL
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述混合液1的流速为10μL/min；
...【技术特征摘要】
1.一种用于冷冻胚胎的产品，其包括芯片、用于制备胚胎凝胶微球的材料和冷冻液；
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于：所述蛇形通道的宽度为50～400μm，设置有3～20个弯折，弯折角度为90°～180°；
3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：所述冷冻液中，所述乙二醇的体积百分浓度为15～40％；所述蔗糖或海藻糖的浓度为0.2～0.8mol/l；所述聚蔗糖的浓度为0.01～1mg/ml；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的产品，其特征在于：所述含钙离子的交联剂为氯化钙、nta-ca或者edta-...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽媛，王晓羽，朱光，李玉民，
申请(专利权)人：杭州海兰时生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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