【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开文本涉及生物学领域。具体地，本公开文本涉及成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)技术。
技术介绍
1、天然原核crispr-cas系统包含具有恒定长度的插入可变序列的短dna序列重复阵列(即，成簇的规律间隔的短回文重复序列或“crispr”)，以及表达crispr相关(“cas”)蛋白的一个或多个序列。转录的crispr基因座(或“crispr阵列”)的rna通过cas蛋白和细胞rna酶的子集加工成小指导rna，所述小指导rna通常具有如下所述的两个组分。存在至少六种不同类型的crispr系统：i型、ii型、iii型、iv型、v型和vi型。在这七个系统中，参与将转录的rna加工成成熟crrna的酶是不同的。在天然原核ii型系统中，指导rna(“grna”)包含两个短的非编码rna种类，称为crispr rna(“crrna”)和反式作用rna(“tracrrna”)。在示例性系统中，grna与cas蛋白形成复合物。grna:cas蛋白复合物结合具有原型间隔子邻近基序(“pam”)和原型间隔子(后者具有与grna的一部分互补的序列)的靶多核苷酸序列。grna:cas蛋白复合物对靶多核苷酸的识别和结合诱导靶多核苷酸的切割。天然crispr-cas系统在原核生物中起免疫系统的作用，其中grna:cas蛋白复合物以类似于真核生物体中的rnai的方式识别和沉默外源遗传元件，从而赋予对外源遗传元件(如感染质粒和噬菌体)的抗性。已经证明，被称为crrna和tracrrna的两种短rna种类可以通过不同长度的短rna茎环连接成单指
2、先导编辑(prime editing)是一种用于编辑dna中的靶向序列的基于crispr的技术，并且它允许各种形式的碱基取代，如颠换和转换突变。它还允许精确的插入和缺失，包括长达约700bp的大缺失。值得注意的是，先导编辑不需要外源dna修复模板。用于先导编辑的基础技术描述于anzalone等人“search-and-replace genome editing withoutdouble-strand breaks or donor dna.”nature 576:7785(2019)149-157中，并且已经报道了随后的进展和变化(anzalone等人nat.biotechnol.2020,883-891；hsu等人nat.commun.2021,12:1034；liu等人nat.commun.2021,12:2121；lin等人nat.biotechnol.2021,923-927；choi等人nat.biotechnol.2022,218-226；nelson等人nat.biotechnol.2022,402-410；chen等人,cell 2021,184,1-18；anzalone等人nat.biotechnol.2022,731-740)。在这些研究中，将cas9切口酶多肽与逆转录酶多肽融合，并且此融合蛋白采用先导编辑指导rna(或“pegrna”)，所述先导编辑指导rna具有新颖设计，使得tracrrna区段在其3'端上添加了以下两个另外的区段：(i)rna模板区段，其是包含融合蛋白的逆转录酶部分的期望编辑的序列，以拷贝到dna靶位点(由cas9切口酶部分靶向)的带切口链的3'端上；和(ii)引物结合区段，其是与带有带切口3'端的靶序列互补的序列，使得所述带切口3'端通过与引物结合序列的序列杂交而被捕获，以允许通过逆转录酶部分对带切口3'端进行引物延伸(如图1所示)。最新进展包括利用一对pegrna在dna靶位点精确安装小到大的编辑(包括大的缺失(长达约1kb)或插入(长达约150bp))的巧妙技术(参见anzalone等人2022；lin等人2021；和choi等人2022)。此后，已经对用于先导编辑的融合蛋白的设计进行了改进。例如，据报道，在逆转录酶(“rt”)部分中引入各种点突变可以增强rt活性(参见anzalone等人2019；arezi和hogrefe,nucl.acids res.2009,473-481)。其他研究发现，在先导编辑器融合蛋白的n末端和c末端两处均添加核定位序列(nls)可增强相对较大的蛋白质向细胞核中的分子转运，促进基因组dna的编辑(参见liu等人2021)。
3、尽管有这些进展，但是本领域仍需要对crispr技术的进一步改进，特别是对基于crispr的系统的效率和稳定性的改进，例如以支持采用基于crispr的基因编辑作为治疗工具。在一些方面，本公开文本解决了这一需求和其他需求。例如，本文所述的方法可以与用于增强针对目的靶序列的特异性的方法组合实施。
技术实现思路
1、本公开文本提供了经化学修饰的crispr grna(特别是先导编辑指导rna(pegrna))以及用于编辑靶核酸序列的相关方法。
2、在第一总体方面，本公开文本提供了一种先导编辑指导rna(pegrna)，所述pegrna包含：与核酸的靶dna序列互补的指导序列；能够与crispr相关(cas)蛋白相互作用的序列，其中所述cas蛋白能够使所述靶序列的互补链产生切口；逆转录酶模板序列(rtt序列)，所述rtt序列包含对所述核酸的序列的一个或多个编辑；引物结合位点序列(pbs序列)，所述pbs序列能够与所述靶序列的互补链(即带切口链)杂交；其中所述pegrna包含5'端和3'端(其中一端是先导编辑端并且另一端被称为“远端”)，以及在所述先导编辑端的5个核苷酸内的一个或多个经修饰的核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸是包含2'修饰和核苷酸间连接修饰的核苷酸，所述2'修饰选自：2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)、2'-氟、2'-o-甲基和2'-脱氧，并且所述核苷酸间连接修饰选自3'-硫代磷酸酯、3'-膦酰基羧酸酯和3'-硫代膦酰基羧酸酯。
3、在第二总体方面，本公开文本提供了一种编辑核酸的序列的方法，所述方法包括：a)使所述核酸与以下接触：能够使所述核酸的单链产生切口的cas蛋白；逆转录酶；和pegrna，所述pegrna包含与所述核酸的靶序列互补的指导序列、与所述cas蛋白相互作用的序列、能够与所述靶序列的互补链结合的引物结合位点序列、以及包含对所述核酸的序列的一个或多个编辑的逆转录酶模板序列；其中所述指导rna包含5'端和3'端以及在先导编辑端的5个核苷酸内的一个或多个经修饰的核苷酸；以及b)通过将所述一个或多个编辑掺入所述核酸的序列中来产生经编辑的核酸，其中每个编辑包括一个或多个核苷酸取代、一个或多个核苷酸的插入、和/或一个或多个核苷酸的缺失。
4、在第三总体方面，本公开文本提供了一种编辑至少两个不同的核酸靶标的方法。所述方法采用两种不同的pegr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种先导编辑指导RNA(pegRNA)，所述pegRNA包含：
2.根据权利要求1所述的pegRNA，所述pegRNA不含有在所述先导编辑端的延伸尾。
3.根据权利要求1或2所述的pegRNA，所述pegRNA包含在所述3’端或所述5’端的延伸尾。
4.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，所述pegRNA包含在所述先导编辑端的5个核苷酸内的两个连续的2'-O-甲基-3'-膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、两个连续的2'-O-甲基-3'-硫代膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、或两个连续的MS。
5.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，所述pegRNA包含在所述先导编辑端的5个核苷酸内的三个连续的2'-O-甲基-3'-膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、三个连续的2'-O-甲基-3'-硫代膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、或三个连续的MS。
6.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，其中所述2'-O-甲基-3'-膦酰基羧酸酯是2'-O-甲基-3'-膦酰基乙酸酯(MP)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，其
8.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，所述pegRNA进一步包含在所述远端的5个核苷酸内的一个或多个经修饰的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的pegRNA，其中在所述远端的5个核苷酸内的所述一个或多个经修饰的核苷酸包括如下核苷酸，所述核苷酸包含(1)选自2'-MOE、2'-氟、2'-O-甲基和2'-脱氧的2'修饰；以及(2)选自硫代磷酸酯、膦酰基羧酸酯和硫代膦酰基羧酸酯的核苷酸间连接修饰。
10.根据权利要求9所述的pegRNA，其中在所述远端的5个核苷酸内的所述一个或多个经修饰的核苷酸包含MS、MP或MSP。
11.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，其中所述引物结合位点和/或所述逆转录酶模板包含2'-脱氧修饰。
12.根据前述权利要求中任一项所述的pegRNA，所述pegRNA是单指导RNA。
13.一种编辑核酸中包含靶序列的靶区域的方法，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述逆转录酶以融合蛋白直接或通过接头共价连接。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述逆转录酶是MMLV逆转录酶或突变的MMLV逆转录酶。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白和/或所述逆转录酶作为编码所述Cas蛋白和/或所述逆转录酶的一种或多种mRNA提供。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述逆转录酶作为编码包含所述Cas蛋白和所述逆转录酶的融合蛋白的mRNA提供。
18.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白和/或所述逆转录酶作为编码所述Cas蛋白和/或所述逆转录酶的一种或多种DNA提供。
19.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述pegRNA作为核糖核蛋白(RNP)提供，并且任选地包封在纳米颗粒中。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法，其中所述接触发生在细胞中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞离体存在。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
23.一种编辑至少两个核酸靶区域的方法，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种先导编辑指导rna(pegrna)，所述pegrna包含：
2.根据权利要求1所述的pegrna，所述pegrna不含有在所述先导编辑端的延伸尾。
3.根据权利要求1或2所述的pegrna，所述pegrna包含在所述3’端或所述5’端的延伸尾。
4.根据前述权利要求中任一项所述的pegrna，所述pegrna包含在所述先导编辑端的5个核苷酸内的两个连续的2'-o-甲基-3'-膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、两个连续的2'-o-甲基-3'-硫代膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、或两个连续的ms。
5.根据前述权利要求中任一项所述的pegrna，所述pegrna包含在所述先导编辑端的5个核苷酸内的三个连续的2'-o-甲基-3'-膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、三个连续的2'-o-甲基-3'-硫代膦酰基羧酸酯修饰的核苷酸、或三个连续的ms。
6.根据前述权利要求中任一项所述的pegrna，其中所述2'-o-甲基-3'-膦酰基羧酸酯是2'-o-甲基-3'-膦酰基乙酸酯(mp)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的pegrna，其中所述2'-o-甲基-3'-硫代膦酰基羧酸酯是2'-o-甲基-3'-硫代膦酰基乙酸酯(msp)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的pegrna，所述pegrna进一步包含在所述远端的5个核苷酸内的一个或多个经修饰的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的pegrna，其中在所述远端的5个核苷酸内的所述一个或多个经修饰的核苷酸包括如下核苷酸，所述核苷酸包含(1)选自2'-moe、2'-氟、2'-o-甲基和2'-脱氧的2'修饰；以及(2)选自硫代磷酸酯、膦酰基羧酸酯和硫代膦酰基羧酸酯的核苷酸间连接修饰。
10.根据权利要求9所述的p...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·E·赖安，D·J·戴林格，R·凯撒，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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