【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食药用菌有效特征性成分检测分析领域，具体的说涉及一种同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法。
技术介绍
1、松杉灵芝(ganoderma tsugae murrill,bull.torrey bot.club 29:601.1902)是灵芝属ganoderma p.karst.真菌，为我国食药用菌之一，2001年，国家将其列入“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，可用于保健产品的开发。
2、松杉灵芝主要自然分布和人工栽培在我国东北地区，是药用真菌灵芝中一个重要的物种，多年来，对其活性成分的研究和开发主要集中在其子实体。松杉灵芝发酵菌丝体虽然也有多篇研究报道，但尚未有人对其中的三萜成分做详细系统的研究。三萜化合物是灵芝属真菌的特征性活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降胆固醇等多种生理活性。专利申请(申请号：202410129852.4，专利技术名称松杉灵芝菌丝体中三萜化合物的抗炎应用)从松杉灵芝发酵菌丝体中首次分离获得了多个三萜化合物，为进一步开发松杉灵芝发酵菌丝体，有必要建立这些三萜化合物的精准定量检测方法，为今后高产活性三萜的松杉灵芝发酵菌丝体产品开发提供质控标准。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法，该方法包括如下步骤：
2、(1)松杉灵芝菌丝体的预处理步骤：将松杉灵芝菌丝体加入甲醇进行超声提取或者60℃加热提取，取上清液，过滤，得到的滤液即为待测样品溶液；配制13个三萜化合
3、(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和13个三萜化合物的混合对照品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
4、(3)化合物质谱信息获得步骤：通过质谱全扫描模式确定化合物的电离方式和母离子信息，再通过质谱优化软件agilent optimizer，对13个三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
5、(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件agilent masshunter data acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对以及碰撞能数据，建立13个三萜化合物的动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring，dmrm)分析方法；同时，对13个三萜化合物的混合对照品溶液和样品溶液进行上样测定；
6、(5)数据分析步骤，运用定量分析软件agilent masshunter quantitativeanalysis，创建13个三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对松杉灵芝菌丝体样品溶液进行定量分析；
7、其中所述的13种三萜化合物为：
8、(22s,24e)-3-oxo-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid(c30h44o5,化合物1)；
9、(22s,24e)-3-oxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid(c32h46o6,化合物2)；
10、ganodermic acid jb(c30h46o4,化合物3)；
11、ganoderic acid p(c34h50o7,化合物4)；
12、15-hydroxy-ganoderic acid s(c30h44o4,化合物5)；
13、ganodermic acid ja(c30h46o4,化合物6)；
14、ganodermic acid tq(c32h46o5,化合物7)；
15、ganoderic acid x(c32h48o5,化合物8)；
16、ganoderic acid mf(c32h48o5,化合物9)；
17、ganoderic acid y(c30h46o3,化合物10)；
18、ganoderic acid me(c34h50o6,化合物11)；
19、ganoderic acid z(c30h48o3,化合物12)；
20、ganoderic acid s1(c30h44o3,化合物13)。
21、优选的，步骤(1)中松杉灵芝菌丝体的预处理步骤为，将待测菌丝体真空冷冻干燥，按料液比1:20-40(重量g：体积ml)(优选的为1：20)加入甲醇，超声提取10-90min(优选的为：超声60min)，提取液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤后再用质谱级甲醇稀释10倍即获得上样用样品溶液；
22、优选的，步骤(1)中13种三萜化合物的混合对照品溶液的配制方法为：分别精密称取13种三萜化合物，用质谱级甲醇配制成混合对照品母液，其中化合物3和化合物6浓度为2μg/ml，化合物8浓度为5μg/ml，其他化合物浓度均为1μg/ml，将母液再用质谱级甲醇逐级稀释2倍、2.5倍、2倍、2倍、2.5倍，即得到不同浓度梯度的混合对照品溶液；
23、优选的，步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用agilent zorbaxeclipse plus c18色谱柱，1.8μm，2.1×50mm，检测波长：240nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为2μl；流速：0.5ml/min；流动相a：0.01％甲酸水溶液；流动相b：甲醇；洗脱程序：0min，32％ a，68％ b；10min，24％ a，76％ b；17min，17％ a，83％ b；18min，0％a，100％b。
24、优选的，通过质谱优化软件(agilent optimizer)，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
25、(22s,24e)-3-oxo-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid(c30h44o5,化合物1)：保留时间：3.12min；母离子：467.3；定量离子：208.9，碰撞能：17；定性离子：207.0，碰撞能25；
26、(22s,24e)-3-oxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid(c32h46o6,化合物2)：保留时间：5.00min；母离子：449.1；定量离子：431.2，碰撞能：13；定性离子：350.1，碰撞能29；
27、ganodermic acid jb(c30h46o4,化合物3)：保留时间：6.17min；母离子：453.1；定量离子：435.3，碰撞能：17；定性离子：105.1，碰撞能65；
28、gan本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法，其特征在于该方法包括如下
2.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法，其中步骤(1)中松杉灵芝菌丝体的预处理步骤为，待测菌丝体冷冻干燥，按料液比1:20-40，重量g：体积ml，加入甲醇，超声提取10-90min，提取液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤后再用质谱级甲醇稀释10倍即获得待测样品溶液。
3.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中步骤(1)中13个三萜化合物的混合对照品溶液的配制方法为：取13种三萜化合物对照品，用质谱级甲醇配制成混合对照品母液，其中化合物3和化合物6浓度为2μg/mL，化合物8浓度为5μg/mL，其他化合物浓度均为1μg/mL，将母液再用质谱级甲醇逐级稀释2倍、2.5倍、2倍、2倍、2.5倍，即得到不同浓度梯度的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent ZORBAX Eclipse P
5.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
6.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，其中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1×50mm，检测波长：240nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为2μL；流速：0.5mL/min；流动相A：0.01％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；洗脱程序：0min，32％A，68％B；10min，24％A，76％B；17min，17％A，83％B；18min，0％A，100％B；质谱分析条件为：大气压化学电离源APCI作为离子源，检测在正离子模式下进行，选用动态多反应监测DMRM，
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法，其特征在于该方法包括如下
2.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体中13种三萜化合物的方法，其中步骤(1)中松杉灵芝菌丝体的预处理步骤为，待测菌丝体冷冻干燥，按料液比1:20-40，重量g：体积ml，加入甲醇，超声提取10-90min，提取液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤后再用质谱级甲醇稀释10倍即获得待测样品溶液。
3.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中步骤(1)中13个三萜化合物的混合对照品溶液的配制方法为：取13种三萜化合物对照品，用质谱级甲醇配制成混合对照品母液，其中化合物3和化合物6浓度为2μg/ml，化合物8浓度为5μg/ml，其他化合物浓度均为1μg/ml，将母液再用质谱级甲醇逐级稀释2倍、2.5倍、2倍、2倍、2.5倍，即得到不同浓度梯度的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的同时检测松杉灵芝菌丝体13种三萜化合物的方法，其中步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱，1.8μm，2.1×50mm，检测波长：240nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为2μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯娜，戴玉成，张劲松，郭晓宇，孔祥明，员瑗，谭贻，颜梦秋，王金艳，周帅，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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