【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的elisa检测方法。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs)是猪的一种急性的高度接触性传染病，发病猪表现高热、耳朵发绀，呼吸困难和嗜睡等症状，也因此病会导致猪只耳朵发绀，所以也俗称为“蓝耳病”。prrs自1987年首次报道以来一直是危害养猪业的重要传染病，造成了巨大的经济损失。prrs的防控一方面主要依赖于生物防控，另一方面依赖于疫苗免疫。prrs的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)，目前prrs的防控难度增大，主要归因于prrsv基因组的不断变异及不同毒株之间的重组。掌握抗prrsv抗体消长规律，对做好猪场prrs防控和净化具有重要意义。
2、prrsv为单股正链rna病毒，有囊膜，病毒粒子大部分呈球形，直径大约25-35nm，prrsv属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。prrsv分为两个较大的基因型：ⅰ型(原欧洲型)和ⅱ型(原北美洲型)。prrsv的基因组长约15kb，5’端具有帽子结构，3’端具有poly(a)尾巴，基因组包含11个开放阅读框orf1a、orf1b、orf2a、orf2b、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7与新鉴定的orf5a和orf2(tf)。中和抗体在抵抗prrsv感染中起着重要的作用，中和抗体的水平也被列为疫
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体elisa检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术使用ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒为参考序列，串联b细胞中和抗体表位，以此为包被抗原建立elisa检测方法，本专利技术提供的检测方法高效、省时、敏感性高、特异性强，适合大规模ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体elisa检测。
2、为实现上述目的，本专利技术主要包括以下内容：
3、本专利技术第一方面，提供了一种ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒b细胞表位中和抗体重组蛋白，所述b细胞表位中和抗体重组蛋白氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、本专利技术第二方面，提供了上述的b细胞表位中和抗体重组蛋白的编码基因。
5、优选的，所述编码基因核酸序列如seq id no:2所示。
6、本专利技术第三方面，提供了包含上述b细胞表位中和抗体重组蛋白编码基因的重组表达载体。
7、本专利技术第四方面，提供了上述b细胞表位中和抗体重组蛋白在制备ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测产品中的应用。
8、本专利技术第五方面，提供了一种用于ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒b细胞表位中和抗体elisa检测试剂盒，所述elisa检测试剂盒使用上述的b细胞表位中和抗体重组蛋白作为包被抗原。
9、所述elisa检测试剂盒包括：包被ⅱ型抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的b细胞表位中和抗体重组蛋白酶标板、nah2po4-na2hpo4缓冲液、pbs洗涤液、pbs封闭液、tmb底物显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。
10、所述b细胞表位中和抗体重组蛋白的包被浓度为2.1-2.4μg/ml；
11、所述b细胞表位中和抗体重组蛋白的包被时间为8-10h。
12、本专利技术第六方面，提供上述elisa检测试剂盒在进行ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学调查中的应用。
13、本专利技术第七方面，提供一种ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体非诊断目的的检测方法，所述检测方法使用上述elisa检测试剂盒对待测样品进行检测。
14、所述检测方法包括如下步骤：
15、(1)包被：使用nah2po4-na2hpo4缓冲液将b细胞表位中和抗体重组蛋白稀释后加样，4-6℃吸附9-11h；包被完毕后，弃去孔中液体，每孔加入tween-20的pbs洗涤液洗涤，最后一次拍干；
16、(2)封闭：每孔加入含脱脂奶粉、tween-20的pbs封闭液，36-38℃封闭1-2h；封闭完毕后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液洗涤，最后一次拍干；
17、(3)一抗孵育：使用pbs稀释待检血清后加样，36-38℃反应1-2h；弃去孔中液体，每孔加入洗涤液洗涤，最后一次拍干；
18、(4)二抗孵育：用含脱脂奶粉、tween-20的pbs封闭液稀释酶标二抗后加样，36-38℃反应1-2h；弃去孔中液体，每孔加入洗涤液洗涤，最后一次拍干；
19、(5)显色读数：每孔单组份tmb底物显色液，36-38℃避光反应25-35min，每孔加入终止液，使用酶标仪读取od450nm值。
20、(6)检测结果判定：根据公式：cut off值＝阳性血清od450nm值(p)与阴性血清od450nm值(n)的比值(p/n)，得到cut off值为0.175，即cut off值≥0.175时判定为阳性，cutoff值＜0.175时判定为阴性。
21、所述酶标二抗为山羊抗猪igg抗体。
22、本专利技术的有益效果：
23、(1)在检测时无需操作病毒和培养细胞，降低了生物安全的风险与生产条件的要求；
24、(2)b细胞表位重组蛋白表达量大、易于纯化，便于大规模的产业化生产；
25、(3)使用b细胞表位重组蛋白作为包被抗原，表位充分暴露，其检测结果能更好的反应体内的中和抗体水平。
26、(4)传统病毒中和实验检测中和抗体需要4-5天的时间，本申请提供的中和抗体的elisa检测方法只需2天就可完成，相对中和实验方法更加省时，显著提高了检测的时效性。
27、(5)本申请将筛选得到的gp2-2、gp2-4、gp2-5、gp3-2、gp3-3、gp4、gp5、m-1片段进行串联，得到包被抗原蛋白bbw，建立了以bbw重组蛋白作为包被抗原的ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的elisa检测方法，并将检测结果与gp2-2、gp2-4、gp2-5串联蛋白，gp3-2、gp3-3串联蛋白，gp4蛋白，gp5蛋白，m-1蛋白为包被抗原的elisa进行比较，结果表明，以bbw重组蛋白作为包被抗原具有较高的特异性。
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1.一种Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒B细胞表位中和抗体重组蛋白，其特征在于，所述B细胞表位中和抗体重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的B细胞表位中和抗体重组蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.包含权利要求2所述的B细胞表位中和抗体重组蛋白编码基因的重组表达载体。
4.权利要求1所述的B细胞表位中和抗体重组蛋白在制备Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测产品中的应用。
5.一种用于Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒B细胞表位中和抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒使用权利要求1所述的B细胞表位中和抗体重组蛋白作为包被抗原。
6.根据权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括：包被Ⅱ型抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的B细胞表位中和抗体重组蛋白酶标板、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、PBS洗涤液、PBS封闭液、TMB底物显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。
7.根据权利要求5所述的ELISA
8.权利要求5-7任一项所述的ELISA检测试剂盒在进行Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学调查中的应用。
9.一种Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述检测方法使用权利要求5-7任一项所述的ELISA检测试剂盒对待测样品进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒b细胞表位中和抗体重组蛋白，其特征在于，所述b细胞表位中和抗体重组蛋白氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述的b细胞表位中和抗体重组蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因核酸序列如seq id no:2所示。
3.包含权利要求2所述的b细胞表位中和抗体重组蛋白编码基因的重组表达载体。
4.权利要求1所述的b细胞表位中和抗体重组蛋白在制备ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测产品中的应用。
5.一种用于ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒b细胞表位中和抗体elisa检测试剂盒，其特征在于，所述elisa检测试剂盒使用权利要求1所述的b细胞表位中和抗体重组蛋白作为包被抗原。
6.根据权利要求4所述的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述elisa检测试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖一红，陈珽，崔京浩，秦立廷，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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