一种脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的方法技术

本发明专利技术公开了一种脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的方法，所述的方法为：将灵芝粗多糖配成１０～３０ｍｇ／ｍｌ的水溶液，离心取上清液，所述的上清液上样，加入装填有阴离子交换剂的径向流色谱柱，然后用纯水洗脱，控制上样流速为２～１０ｍｌ／ｍｉｎ，洗脱流速为１０～５０ｍｌ／ｍｉｎ，收集洗脱液，至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液，经后处理制得灵芝多糖纯品。本发明专利技术的有益效果在于：同时脱除粗多糖中蛋白质和色素，大大缩短多糖的分离提纯时间，有利于最大限度的保存多糖活性，提高了灵芝粗多糖纯化效率，操作过程不使用有机溶剂，条件温和，后续处理方便，环境污染小，所采用的离子交换树脂成本低，且可重复使用，可有效降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分离纯化
，具体涉及。
技术介绍
真菌多糖是由10个分子以上的单糖通过糖苷键链接而成的高分子多聚物，是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖。真菌多糖以其多方面的生物活性和安全无毒副作用而备受医药和食品工业的 。灵芝是药用真菌的一种，自古被作为 贵中药，是一种营养和保健价值极高的大型担子菌。灵芝多糖是灵芝主要活性成分之一，已知的灵芝多种药理活性大多和灵芝多糖有关。灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、清除自由基、活血化瘀、抗凝血、降血糖及护肝等功效。 多糖作为一种生物活性制品，一般需要分离纯化到一定纯度后才能更好地发挥作用。尤其是要将其开发成对纯度要求较高的药品时，除去其中所含杂蛋白是一个必不可少的纯化步骤。对于多糖针剂制品而言，更是必须脱除多糖中的蛋白质，否则蛋白质容易成为热敏源。而多糖制品中色素的纯在，会对分光光度法测多糖时有很大影响，同时也严重影响成品的感官质量，需通过一定方法将其脱除。另外，对多糖结构作进一步分析与鉴定时，也要求必须除去其中的蛋白质和色素类杂质。因此，粗多糖中蛋白质和色素的脱除是多糖分离过程中的关键步骤。 通过热水浸提等方法所得灵芝粗多糖中往往混杂着色素、低聚糖、蛋白质等杂质，需进一步分离纯化，提高多糖纯度，以达到相关产品原料的标准。通常的方法是对其中的蛋白质和色素采取不同的方法进行分别去除。例如采用Sevag试剂法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法(TCA法)、鞣酸法、酶-Sevag联用法及大孔树脂吸附法等方法脱除粗多糖中的蛋白质，其中Sevag法是经典的脱蛋白方法，条件比较温和，但需反复数十次才能除去尽量多的蛋白质。而粗多糖中色素的脱除通常采用活性炭脱色、H2O2脱色或树脂脱色等方法。以上方法多以有机溶剂等对粗多糖进行处理，有机试剂用量大、耗时较长、成 高，且多糖损失较为严重；另外，生产 中分液后，多糖溶液中仍残留有毒性较大的有机溶剂，需蒸发去除。 径向流色谱法(Radial Flow Chromatography，RFC)是近十年来发展起来的一种新型的色谱分离分析技术。径向流色谱柱由两个多孔渗透树脂玻璃同心圆筒及介于两者之间的色谱分离介质构成，主要包括内、外树脂玻璃圆筒、分离介质、树脂玻璃顶板和底板、以及不锈钢中心流体分布器等组件，采用独特的径向流动设计，流动相携带样品沿径向迁移，不同于传统轴向色谱柱的流体在柱内从一端流向另一端。从而克服了传统色谱技术操作压力高、流速低、在大规模处理时不便放大等缺点，具有操作压力低、流速高、线性放大容易及处理量大等突出优势。 在用色谱法分离纯化生物样品时，为增加制备量，一般需要对柱结构和尺寸进行相应的调整一是保持色谱柱的长度不变，增加色谱柱的直径；二是保持色谱柱的直径不变，增加色谱柱长度，这两种方法在一定程度上都可以增加样品制备量。然而在传统轴向色谱柱中，随着色谱柱长度的增加，柱压相应增加，样品保留时间延长，对柱子的要求也增加，同时也给实际分离操作带来诸多不变。而对于径向流色谱来说，由于它特殊的径向流动设计，使得其在只增加柱长，保持色谱柱直径不变的情况下，便可线性增大样品处理量，即样品处理规模可在保持相似色谱条件下直接放大，各组分保留时间及分辨情况基本相同。因为保持径向色谱柱的直径不变时，样品通过色谱柱内填料的途径也未改变，因此分离过程基本保持一致；同时，由于色谱柱的长度增加，色谱柱的柱容量也增加，从而处理量就线性增大。 目前国内外在多 纯化过程中，对粗多糖中的蛋白质和 等通常先后采取不同的工艺方法进行分别去除，以提高多糖纯度，但是如此操作工艺复杂、耗时，对多糖类生物活性物质的纯化及工厂化生产十分不利。且传统脱蛋白脱色方法多以有机溶剂等对粗多糖进行处理，不仅有机溶剂消耗数量巨大，且处理过程中多糖损失严重、成本高、操作周期长、污染环境，对操作人员伤害较大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种可同时、快速脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的高效、安全、经济的方法。 本专利技术采用的技术方案为 ，所述的方法为将灵芝粗多糖配成10～30mg/ml的水溶液，离心取上清液，加入装填有阴离子交换剂的径向流色谱柱，然后用纯水洗脱，控制上样流速为2～10ml/min，洗脱流速为10～50ml/min，收集洗脱液，至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液，经后处理制得灵芝多糖纯品。 所述的阴离子交换剂为经过预处理的弱碱性阴离子交换剂，所述的预处理方法为弱碱性阴离子交换剂置于0.5～1.0mol/L(优选0.5mol/L)的碱水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，再置于0.5～1.0mol/L的酸水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，最后置于0.5～1.0mol/L(优选0.5mol/L)的碱水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，得所述阴离子交换剂。 所述的弱碱性阴离子交换剂可选自A103S或A830。 所述的碱水溶液为NaOH水溶液或KOH水溶液，优选为NaOH水 所述的酸水溶液为盐酸水溶液。 本专利技术所述的灵芝粗多糖的提取方法为取灵芝，粉碎，按灵芝、水的质量比1∶15～30的配比加入水，于95～100℃下提取2～3小时，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物醇沉、离心，取沉淀物干燥得灵芝粗多糖。 所述的阴离子交换剂使用后可再生利用，所述的再生方式为使用过的阴离子交换剂用1～2.5mol/L的NaCl水溶液洗脱，直至洗脱液为无色并且检测不出蛋白质为止，再用纯水洗脱至洗脱液中不含NaCl。 本专利技术所述的后处理步骤为洗脱液减压蒸馏除水后，干燥得灵芝多糖纯品。 本专利技术分别用苯酚-硫酸法和Folin-酚法检测原料液及洗脱液中多糖和蛋白质含量，计算多糖回收率和蛋白脱除率。利用比色法在450nm下测定原灵芝上清液及洗脱液的吸光度，并计算色素脱除率。 较为具体的，推荐本专利技术所述的脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的方法按照以下步骤进行将灵芝粗多糖配成10～30mg/ml的水溶液，离心取上清液，所述的上清液上样，加入装填有阴离子交换剂的径向流色谱柱，所述的阴离子交换剂为经过预处理的弱碱性阴离子交换剂，所述的预处理方法为弱碱性阴离子交换剂A103S置于0.5～1.0mol/L的NaOH水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，再置于0.5～1.0mol/L的盐酸水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，最后置于0.5～1.0mol/L的NaOH水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性；然后用纯水洗脱，控制上样流速为2～10ml/min，洗脱流速为10～50ml/min，收 液，至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液，减压蒸馏除水后，干燥得灵芝多糖纯品。 本专利技术方法的依据是，在自然pH下灵芝多糖中所含多糖一般呈电中性而蛋白质带电的性质，利用离子交换剂与具有相反电荷的生物分子起相互交换吸附的性质，并根据所选离子交换剂对灵芝粗多糖中的色素物质有一定的吸附作用，直接将灵芝粗多糖液通过径向流离子交换色谱，同时起到快速脱除其中的蛋白质和色素的作用，提高灵芝多糖纯度。 本专利技术的有益效果在于 (1)解决了传统多糖分离纯化过程中分步脱除粗多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述的方法为：将灵芝粗多糖配成１０～３０ｍｇ／ｍｌ的水溶液，离心取上清液，所述的上清液上样，加入装填有阴离子交换剂的径向流色谱柱，然后用纯水洗脱，控制上样流速为２～１０ｍｌ／ｍｉｎ，洗脱流速为１０～５０ｍｌ／ｍｉｎ，收集洗脱液，至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液，经后处理制得灵芝多糖纯品。

【技术特征摘要】
1.一种脱除灵芝粗多糖中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述的方法为将灵芝粗多糖配成10～30mg/ml的水溶液，离心取上清液，所述的上清液上样，加入装填有阴离子交换剂的径向流色谱柱，然后用纯水洗脱，控制上样流速为2～10ml/min，洗脱流速为10～50ml/min，收集洗脱液，至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液，经后处理制得灵芝多糖纯品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的阴离子交换剂为经过预处理的弱碱性阴离子交换剂，所述的预处理方法为弱碱性阴离子交换剂置于0.5～1.0mol/L碱水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，再置于0.5～1.0mol/L的酸水溶液中浸泡2～4小时，用纯水洗涤至中性，最后置于0.5～1.0mol/L的碱水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，得所述阴离子交换剂。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的碱水溶液为NaOH水溶液或KOH水溶液。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的酸水溶液为盐酸水溶液。5.如权利要求1～4之一所述的方法，其特征在于所述的灵芝粗多糖的提取方法为取灵芝，粉碎，按灵芝、水的质量比1∶15～30的配比加入水，于95～100℃下提取2～3小时，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物醇沉、离心，取沉淀物干燥得灵芝粗多糖。6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵平，孙培龙，何晋浙，姜慧燕，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]