【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开涉及生物检测，尤其涉及一种基于rpa结合crispr/cas12a检测哈维氏弧菌的试剂盒、其方法与应用。
技术介绍
1、哈维氏弧菌(vibrio harveyi)是水产品中存在的一种常见的食源性致病性弧菌，存在于世界各地的养殖场以及患病鱼类、食品和动物粪便中，是重要的人畜共患病原体，可引起水产养殖动物肌肉坏死、皮肤溃疡和尾腐病等，导致养殖鱼类大规模死亡，给水产养殖业带来巨大经济损失。哈维氏弧菌也是一种新兴的肠道病原体和食源性病原体，致使人类患有急性肠胃炎，伤口感染等疾病，对水产品质量安全以及人类健康构成威胁。目前对哈维氏弧菌的治疗尚无有效手段，主要依赖于抗生素，因此病原体的早期检测对于预防和控制显得尤为重要。
2、目前已经建立了多种检测哈维氏弧菌的方法。徐媛媛等建立了荧光定量pcr方法检测哈维氏弧菌，特异性良好，灵敏度为2.42×101copies/μl。sithigorngul利用免疫层析试纸条与胶体金偶联快速检测哈维氏弧菌，操作简便，胶体金方法存在灵敏度普遍不高，难以实现定量测定的问题。武静利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)采集哈维氏弧菌蛋白指纹图谱，对不同地点分离的菌株进行聚类分析，为哈维弧氏弧菌感染的快速诊断及流行病学分析提供了理论依据。但这些方法都依赖特殊的检测设备，成本较高，需要专业的实验室环境和检测人员，无法实现现场快速检测。
3、新兴的重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)，对
4、然而，rpa技术仍然存在一些问题。首先，rpa技术的灵敏度不够高，无法检测到低浓度的目标序列。其次，rpa技术的反应条件较为苛刻，需要精确控制温度和反应时间等因素。此外，rpa技术的成本也较高，需要购买专门的试剂和设备。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种基于rpa结合crispr/cas12a的哈维氏弧菌检测试剂盒及检测方法。主要包括用于rpa特异扩增哈维氏弧菌toxr基因的引物，crispr/cas12a的grna和荧光报告分子reporter，检测方法及试剂盒；本专利技术建立的rpa等温扩增联合crispr/cas12a的快速检测新方法。首先通过rpa扩增得到包含靶序列的片段，然后将rpa扩增产物加入crispr/cas12a检测体系中。由于在反应体系中加入两端分别连接荧光基团和淬灭基团的信号报告探针，当cas12a蛋白在grna的帮助下，识别具有靶向序列的靶向dna后，被激活的cas12a蛋白可以切割带有该信号的信号报告探针，从而释放荧光信号，实现检测。本专利技术建立的rpa-crispr/cas12a方法具有简便快速、特异性强、灵敏度高、不易造成实验室污染的优势，为水产养殖人鱼共患致病菌的快速检测提供了新方法。
2、本专利技术一方面提供了一种基于rpa结合crispr/cas12a检测哈维氏弧菌的试剂盒，包括：基于rpa结合crispr/cas12a检测哈维氏弧菌的引物、grna序列和荧光报告分子reporter；
3、引物包括：
4、上游引物vh-f2具有如seq id no.1所示的核苷酸序列：
5、5’-ggatgactcaagccttactcaaacgatttc-3’；
6、下游引物vh-r2具有seq id no.2所示的核苷酸序列：
7、5’-tttgtgttcttttgtgcaggtgcagatttt-3’；
8、所grna序列具有seq id no.3所示的核苷酸序列：
9、5’-gcttcagaagatagtgggctatctacacttagtagaaattactatagtgagtcgt atta-3’；
10、所述荧光报告分子reporter具有seq id no.4所示的核苷酸序列：
11、5’-fam-gggttttttggg-bhq1-3’。
12、对于上文所示的技术方案，进一步优选的，所述试剂盒还包括cas12a蛋白。以上述引物、grna配合cas12a蛋白和荧光报告分子，具有较好的检测效果。
13、对于上文所示的技术方案，进一步优选的，所述试剂盒还含有primer free反应缓冲液(dnase、dntp solution mix、t7 rnapolymerase)、28mm mgoac、10×反应缓冲液(50mmnacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、100μg/ml bsa)、阳性对照品以及阴性对照品。
14、本专利技术还涉及一种利用上文所述的试剂盒，基于rpa结合crispr/cas12a的检测哈维氏弧菌的方法，所述方法包括：
15、(1)样本基因组dna提取：取待测样本，提取样本基因组dna；
16、(2)rpa扩增：以针对靶基因的特异性扩增引物vh-f2和vh-r2，通过rpa方法扩增步骤(1)提取得到的待测样本基因组dna，得到rpa扩增产物；
17、所述rpa反应体系组成如下：总体积为50μl，其中包括上游引物2μl(浓度9μm)，下游引物2μl，primer free反应缓冲液29.4μl，28mm mgoac，3μl哈维氏弧菌基因组dna，其余用depc水补足；
18、更进一步优选的情况下，步骤(2)中的引物的浓度9μm；哈维氏弧菌基因组dna的浓度为20-200ng/μl，优选浓度为154.72ng/μl。
19、rpa扩增程序：恒温37℃反应20min。
20、(3)crispr/cas12a检测：待步骤(2)反应结束后，取步骤(2)中的2μl rpa扩增产物，加入到40μl的crispr/cas12a反应体系中继续进行检测。crispr/cas12a反应体系包括荧光报告分子、cas12a蛋白和g rna以及检测试剂。恒温37℃反应40min，读取检测信号。
21、更进一步优选的情况下，10×反应缓冲液4μl，0.4μl cas12a蛋白(10μm)，1.6μlgrna(2μm)，30.8μl depc水，2μl本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RPA结合CRISPR/Cas12a检测哈维氏弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：基于RPA结合CRISPR/Cas12a检测哈维氏弧菌的引物、gRNA和荧光报告分子；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas12a蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有Primer Free反应缓冲液、MgOAc、反应缓冲液、阳性对照品以及阴性对照品。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中Primer Free反应缓冲液包括DNase、dNTP Solution Mix、T7 RNAPolymerase。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的反应缓冲液包括NaCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA。
6.一种利用权利要求1所述的试剂盒，基于RPA结合CRISPR/Cas12a的检测哈维氏弧菌的方法，所述方法包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的引物的浓度9μM；哈维氏弧菌基因组DN
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述CRISPR/Cas12a的40μL反应体系组成如下：10×反应缓冲液4μL，0.4μLCas12a蛋白(10μM)，1.6μL gRNA(2μM)，30.8μLDEPC水，2μL RPA扩增产物，1.2μL荧光报告分子(10μM)。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的酶标仪检测荧光强度：激发波长480nm；扫描波长：510-650nm。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的加入迟缓爱德华氏菌ATCC15947标准菌株提取的基因组DNA作为阴性对照；以哈维式弧菌ATCC3384标准菌株提取的基因组DNA作为阳性对照。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rpa结合crispr/cas12a检测哈维氏弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：基于rpa结合crispr/cas12a检测哈维氏弧菌的引物、grna和荧光报告分子；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas12a蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有primer free反应缓冲液、mgoac、反应缓冲液、阳性对照品以及阴性对照品。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中primer free反应缓冲液包括dnase、dntp solution mix、t7 rnapolymerase。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的反应缓冲液包括nacl、tris-hcl、mgcl2、bsa。
6.一种利用权利要求1所述的试剂盒，基于rpa结合crispr/cas12...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑秋月，仲瑶，凌莉，王金玲，曹际娟，杨春华，陈文锐，贾惠齐，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：
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