【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种基于as1411适配体纳米花修饰的毛细管整体柱及其制备方法和在手性分离中的应用，更具体的，是基于as1411适配体纳米花修饰的毛细管硅胶整体柱。
技术介绍
1、点击化学是2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家 sharpless提出的一种快速合成大量化合物的新方法。通过点击化学反应，可将分子片段拼接起来，根据实际需求合成特定的化合物。基于其反应条件温和，产率高，适用范围广，选择性好等优点，点击化学已广泛应用于化学、材料和生命科学等领域。然而，其作为生物分子的固定化方法应用于毛细管电色谱手性分离却较少有文献报道。
2、由于手性药物的对映异构体在人体内呈现出不同的药理毒理效应，手性分离具有重要的现实意义。内源性生物分子包括蛋白质、多糖、dna等可用作毛细管柱的手性固定相。手性选择剂的固定化过程中，固定化方法的选择是影响固定化生物分子性能优劣的关键因素。as1411适配体序列为5’-ggtggtggtggttgtggtggtggtgg-3’，是一种靶向核仁素的核酸适配体，常与纳米材料结合应用于癌症治疗。但其用于手性选择剂固定化于毛细管柱内构建毛细管电色谱手性分离体系，鲜有文献报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于拓宽目前可使用手性选择剂固定化方法的范围，提供一种基于as1411适配体的纳米花修饰毛细管整体柱应用于手性分离的方法。将纳米花手性选择剂键合于功能化的毛细管硅胶整体柱上，制备获得的纳米花修饰毛细管硅胶整体柱应用于手性分子
2、为解决其技术问题本专利技术所采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种毛细管整体柱，其中的手性固定相为基于as1411适配体的纳米花。
4、在本专利技术的一些具体的实施例中，制备了巯基化的as1411适配体纳米花键合乙烯基修饰的毛细管硅胶整体柱，以及氨基化的as1411适配体纳米花键合氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱。
5、本专利技术中，制备基于as1411适配体的纳米花，其合成步骤如下：将模板链和引物链混合在10×dna连接缓冲液中，加热反应（一般在95 ℃条件下加热5 min），随后缓慢降温到室温，得退火产物；采用t4 dna连接酶连接退火产物，在室温下反应（一般4 h）获得环化dna模板。将环化dna模板与phi29 dna聚合酶，dntps，bsa在30 ℃条件下共孵育3 h，通过75 ℃加热10 min终止该反应，离心沉淀，去离子水进行冲洗，经液体结晶获得巯基或氨基化的纳米花。
6、本专利技术中，制备毛细管硅胶整体柱，其合成步骤如下：首先将毛细管用碱和酸进行预处理，将聚乙二醇、尿素、醋酸和四甲氧基硅烷混合，在冰浴下搅拌形成溶胶；将上步形成的溶胶超声脱气，注入已预处理的毛细管柱中，封端后置于40 ℃水浴锅中反应40小时后取出，120 ℃加热3小时，放置一周，程序升温至320 ℃焙烧24小时，得到毛细管硅胶整体柱。
7、将上述巯基或氨基化的基于as1411适配体的纳米花用于修饰毛细管硅胶整体柱。具体如下：
8、制备巯基化的纳米花修饰毛细管整体柱，其合成步骤如下：将10%含乙烯基的硅烷偶联剂（乙烯基三甲氧基硅烷）的甲苯溶液注入酸化后的硅胶整体柱中，封端后110 ℃反应6 h，用甲苯和无水甲醇冲洗除杂，得到乙烯基修饰的硅胶整体柱。将dtt（二硫苏糖醇）溶液与基于as1411适配体的纳米花溶液在室温下反应0.5-1 h，加入aiba（2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐）混合均匀，得到基于as1411适配体的纳米花的混合溶液；将混合溶液灌入乙烯基修饰的硅胶整体柱中，置于55 ℃的水浴锅中反应至少5 h。然后缓冲液冲洗去除未反应的纳米花，得到巯基化的纳米花修饰的毛细管硅胶整体柱，贮存于电泳缓冲液中。
9、其中，dtt溶液的浓度为500 nm，基于as1411适配体的纳米花溶液的浓度为0.001μmol/l- 1 μmol/l。所述dtt溶液与基于as1411适配体的纳米花溶液的体积比为1:9。所述混合溶液中，aiba的终浓度为3 mg/ml。
10、制备氨基化的纳米花修饰毛细管整体柱，其合成步骤如下：将10%含氨基的硅烷偶联剂（例如3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷）的甲苯溶液注入酸化后的硅胶整体柱中，封端后于110 ℃反应6小时，用甲苯和无水甲醇冲洗除杂，得到氨基修饰的硅胶整体柱；将氧化石墨烯水溶液超声分散后用氢氧化钾溶液稀释（氧化石墨烯和氢氧化钾的质量比为1:2），注入氨基化的硅胶整体柱中，封端后于40 ℃反应2小时，用水冲洗至中性，无水甲醇冲洗除杂，得到氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱。采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（浓度至少为20 mmol/l）对氧化石墨烯修饰的硅胶整体柱进行功能化，接着将氨基化的基于as1411适配体的纳米花溶液灌入整体柱中（反应至少5小时），然后缓冲液冲洗去除未反应的纳米花，得到氨基化的纳米花修饰的毛细管硅胶整体柱，贮存于电泳缓冲液中。
11、其中，用于制备巯基化基于as1411适配体纳米花的单链dna模板链和引物的序列分别为：
12、模板链1：5’ - phosphate - tga acc ctc tga ttt cca cca cca cca caa ccacca cca cct ttc gag gag acg taa gct tcg acc ggc tcg gat gt-3’；
13、引物链1：5’-sh-aga ggg ttc aac atc cga gc-3’。
14、用于制备氨基化基于as1411适配体纳米花的单链dna模板链和引物的序列分别为：
15、模板链2：5’ - phosphate - cac aac cac cac cac caa atc atg cgc gtc gttgta gct agc cta tcg agc gaa ccg gag cgg tcg ttg tag cta gcc tgg ccg agg aaccac cac cac-3’；
16、引物链2：5’-nh2-gtg gtg gtt gtg gtg gtg gtg gtt-3’。
17、本专利技术还提供了基于as1411适配体的纳米花修饰毛细管整体柱的应用，即用于毛细管电色谱手性分离。
18、包括如下步骤：将手性分子溶于电泳缓冲液中，配制样品溶液；基于as1411适配体的纳米花修饰毛细管整体柱经电泳缓冲液进行平衡后（一般30 min左右）进样，电泳分离条件为10 kv进样1-6 s，分离电压10 kv，缓冲液浓度20 mm。在该条件下基于as1411适配体的纳米花修饰毛细管整体柱可分别对手性分子包括苯丙氨酸、普萘洛尔、2’-脱氧腺苷、氯苯那敏及阿替洛尔实现基线分离。
19、专利技术人首先采用氧化石墨烯纳米材料将基于as1411本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱中的手性固定相为基于AS1411适配体的纳米花。
2.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱是巯基化的AS1411适配体纳米花键合乙烯基修饰的毛细管硅胶整体柱。
3.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱是氨基化的AS1411适配体纳米花键合氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱。
4.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述基于AS1411适配体的纳米花是由单链DNA模板和引物在DNA连接酶作用下闭合成的环状DNA模板经滚环扩增形成的纳米花结构；所述单链DNA模板的5’端磷酸化，所述引物的5’端氨基化或巯基化。
5.根据权利要求4所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述单链DNA模板的核苷酸序列为：5’-Phosphate-TGA ACC CTC TGA TTT CCA CCA CCA CCA CAA CCA CCA CCA CCT TTCGAG GAG ACG TAA GCT TCG ACC GGC TCG GAT GT-3’；所述
6.根据权利要求4所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述单链DNA模板的核苷酸序列为：5’-Phosphate-CAC AAC CAC CAC CAC CAA ATC ATG CGC GTC GTT GTA GCT AGC CTATCG AGC GAA CCG GAG CGG TCG TTG TAG CTA GCC TGG CCG AGG AAC CAC CAC CAC-3’；所述引物的核苷酸序列为：5’-NH2-GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG GTT-3’；合成氨基化的AS1411适配体纳米花。
7.一种如权利要求2所述的毛细管整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将二硫苏糖醇溶液与巯基化的AS1411适配体纳米花溶液在室温下反应0.5 h-1 h，加入2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐，混合均匀，得到基于AS1411适配体的纳米花的混合溶液；将混合溶液灌入乙烯基修饰的硅胶整体柱中，置于55 ℃的水浴锅中反应至少5 h。然后缓冲液冲洗去除未反应的纳米花，得到巯基化的纳米花修饰的毛细管硅胶整体柱，贮存于电泳缓冲液中。
8.一种如权利要求3所述的毛细管整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的磷酸盐溶液注入氧化石墨烯功能化的硅胶整体柱至少1小时，再注入氨基化的AS1411适配体纳米花溶液反应至少5小时，用电泳缓冲液进行冲洗，得到氨基化的纳米花修饰毛细管硅胶整体柱，贮存于电泳缓冲液中。
9.一种如权利要求1所述的毛细管整体柱在手性分离中的应用，其特征在于，应用方法为：将手性分子溶于电泳缓冲液中，配制样品溶液；基于AS1411适配体纳米花修饰的毛细管整体柱经电泳缓冲液进行平衡后进样，电泳分离条件为10 kV进样1-6 s，毛细管电泳分离电压为10 kV，缓冲液浓度20 mmol/L，pH7.4。
10.根据权利要求9所述的毛细管整体柱在手性分离中的应用，其特征在于，所述手性分子为苯丙氨酸、普萘洛尔、2’-脱氧腺苷、氯苯那敏及阿替洛尔中的一种。
...【技术特征摘要】
1.一种毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱中的手性固定相为基于as1411适配体的纳米花。
2.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱是巯基化的as1411适配体纳米花键合乙烯基修饰的毛细管硅胶整体柱。
3.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述毛细管整体柱是氨基化的as1411适配体纳米花键合氧化石墨烯修饰的毛细管硅胶整体柱。
4.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述基于as1411适配体的纳米花是由单链dna模板和引物在dna连接酶作用下闭合成的环状dna模板经滚环扩增形成的纳米花结构；所述单链dna模板的5’端磷酸化，所述引物的5’端氨基化或巯基化。
5.根据权利要求4所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述单链dna模板的核苷酸序列为：5’-phosphate-tga acc ctc tga ttt cca cca cca cca caa cca cca cca cct ttcgag gag acg taa gct tcg acc ggc tcg gat gt-3’；所述引物的核苷酸序列为：5’-sh-aga ggg ttc aac atc cga gc-3’；合成巯基化的as1411适配体纳米花。
6.根据权利要求4所述的毛细管整体柱，其特征在于，所述单链dna模板的核苷酸序列为：5’-phosphate-cac aac cac cac cac caa atc atg cgc gtc gtt gta gct agc ctatcg agc gaa ccg gag cgg tcg ttg tag cta gcc tgg ccg...
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