【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境毒理、生态毒理，具体涉及一种高通量筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法。
技术介绍
1、抑郁症是一种常见的心理疾病。据世界卫生组织(who)统计，截至2019年，全世界有超过2.8亿人受抑郁症困扰，抑郁症已成为世界第二大疾病负担，而且还在快速增长中。抗抑郁药使用量逐年上升，药物使用后会随着污水厂进入地表水，目前在全世界范围内的水环境中检测到多种ng～μg/l浓度的抗抑郁药。
2、抗抑郁药的作用机制是抑制sert对血清素的重吸收。sert位于中枢神经系统的突触前膜上，在正常生理状态下，神经系统中缝背核处产生神经递质血清素，经神经元传递由突触小泡经胞吐作用释放至突触间隙，作用于突触后膜的血清素受体，再由突触前膜的血清素转运蛋白进行再摄取。抑郁症患者大脑中释放至突触间隙的血清素含量低，对突触后膜血清素受体的刺激就会降低，导致整个信号通路强度变弱。抗抑郁药会抑制突触前膜sert对突触间隙内血清素的再摄取，从而提高突触间隙内血清素含量，达到治疗抑郁症的效果。
3、抗抑郁药的作用靶点为血清素转运体(sert)，在脊椎动物体内高度保守，水环境中的抗抑郁药等污染物可通过作用于非靶标生物的sert，影响水生生物的行为。已有研究表明长期暴露含有低浓度抗抑郁药的环境水体，会引起鱼类的异常行为。
4、基于细胞模型的体外测试方法具有高通量、灵敏度高、假阳性率低、经济性强的特点，受到广泛关注。然而，到目前为止，尚没有针对斑马鱼sert体外方法用于筛查环境中的污染物。
技术实现思
1、鉴于此，本专利技术的目的是提供了一种高通量筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法。本专利技术构建了表达斑马鱼zsert的细胞模型，提供一种基于荧光分光光度法的筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法，用于高通量检测zsert与抗抑郁药污染物的结合亲和力强弱，从而发现环境中对鱼类有毒性的抗抑郁药污染物。
2、本专利技术目的是通过以下方式实现：
3、本专利技术提供一种高通量筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法，包括以下步骤：
4、(1)将斑马鱼血清素转运体zsert基因插入到载体中，构建zsert质粒；
5、(2)将100-200μl opti-mem与100ng zsert质粒混合均匀，将100-200μl opti-mem与2-3μl lipofectamine 2000试剂混合均匀，然后与zsert质粒混合物混合均匀，将所得的混合物在室温下培养10-30分钟，然后加入到培养有细胞的孔板中，瞬时转染入细胞中；
6、(3)将步骤(2)得到的转染质粒的细胞接种到孔板中，培养1-2小时，加入待测溶液，培养5-20分钟后，加入app溶液，在37℃、5％ co2下培养0.5-2小时；
7、(4)去除培养基，清洗后，加入hbss，通过酶标仪在激发波长485nm，发射波长525nm条件下，检测细胞内的app荧光强度。
8、基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的zsert基因的核苷酸序列如seqid no：1所示。
9、基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的载体为invitrogen pcdna3.1，cmv为启动子，zsert前后选择的限制性内切酶位点分别为bamhi(识别序列ggatcc)和noti(gcggccgc)。
10、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的细胞为hek-293细胞。
11、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中瞬时转染的条件为：在37℃、5％ co2下培养10-30小时。
12、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中细胞接种密度为1-9×104cells/well。
13、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述的待测溶液中的抑制剂为duloxetine，fluoxetine，paroxetine，citalopram，o-desmethylvenlafaxine，sertraline，n-desmethylvenlafaxine，tramadol中的一种或两种以上的组合。
14、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述的抑制剂的浓度为10-5～10-10m。
15、基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述的app的浓度为0.5-9.0×10-6m。
16、基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中清洗的具体过程为：每孔添加50μlhbss，清洗后，再吸去hbss，去除多余app。
17、基于上述技术方案，进一步地，以接种含zsert的细胞、且不添加app和抑制剂的实验为阴性对照组；以接种含zsert的细胞、仅添加app溶液的实验为阳性对照组；待测溶液中的抑制剂抑制app摄取>20％时，被定义为具有抑制作用。
18、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果:
19、本专利技术提供的zsert抑制剂体外活性筛选的方法是一种新的针对zsert抑制剂的体外活性检测方法，与传统的同位素标记方法相比，本专利技术的方法具有高灵敏度、低成本、高特异性，对设备与测试环境要求不高，可避免放射性污染等优点，且可用于高通量筛选zsert抑制剂，为sert抑制剂的体外活性评价提供更多的选择。
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1.一种高通量筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的zSERT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的载体为InvitrogenpcDNA3.1，CMV为启动子，zSERT前后选择的限制性内切酶位点分别为BamHI(识别序列GGATCC)和NotI(GCGGCCGC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞为HEK-293细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中瞬时转染的条件为：在37℃、5％CO2下培养10-30小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中细胞接种密度为1-9×104cells/well。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的待测溶液中的抑制剂为Duloxetine，Fluoxetine，Paroxetine，Citalopram，O-Desmethylvenl
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的抑制剂的浓度为10-5～10-10M；所述的APP的浓度为0.5-9.0×10-6M。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中清洗的具体过程为：每孔添加50μL HBSS，清洗后，再吸去HBSS，去除多余APP。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以接种含zSERT的细胞、且不添加APP和抑制剂的实验为阴性对照组；以接种含zSERT的细胞、仅添加APP溶液的实验为阳性对照组；待测溶液中的抑制剂抑制APP摄取>20％时，被定义为具有抑制作用。
...【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选斑马鱼血清素转运体抑制剂的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的zsert基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的载体为invitrogenpcdna3.1，cmv为启动子，zsert前后选择的限制性内切酶位点分别为bamhi(识别序列ggatcc)和noti(gcggccgc)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞为hek-293细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中瞬时转染的条件为：在37℃、5％co2下培养10-30小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中细胞接种密度为1-9×104cells/well。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)...
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