【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物，涉及蛋白表达技术，具体是涉及一种增强型胞质表达系统和表达质粒及其应用。
技术介绍
1、真核细胞mrna的典型结构是具有5'末端的m7g帽和3'末端的poly(a)尾，这两个组分在mrna的翻译和稳定性维持中发挥了重要作用，帽依赖性扫描机制是绝大多数拥有m7g帽和poly(a)尾的真核细胞mrna进行翻译起始的经典方式。基于t7 rna聚合酶(t7rnapolymerase，t7 rnap)的胞质表达系统在哺乳动物细胞中所转录的mrna无5'm7g帽结构，需引入内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，ires)元件以增强翻译功能实现蛋白表达。胞质表达系统无需质粒进入细胞核即可表达，可显著提高有效转染效率。然而，ires介导的翻译水平远低于5'm7g。2019年， ph等(nucleic acids res.2019)在t7rnap的n端增加了非洲猪瘟病毒来源的np868r加帽酶获得具有转录、加帽双功能的t7rnap，基于双功能t7 rnap的胞质表达系统(c3p3)无需借助ires介导翻译，显示了优异的蛋白表达能力。然而，c3p3系统仍需要细胞核启动子表达双功能t7 rnap，这样会导致其胞质中的含量可能未满足外源基因转录需求，存在提升空间。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提供增强型胞质表达系统、包括该表达系统的表达质粒及其在增强胞质表达外源基因中的应用。
2、本专利技术的第一个方面，是提供一种胞
3、在其中一些实施例中，所述的胞质表达系统从5’至3’依次包括以下元件的序列：细胞核启动子，t7启动子，非洲猪瘟病毒的加帽酶，t7 rna聚合酶，bghpa，poly a尾，核酶，t7终止子。
4、在其中的一些实施例中，所述t7启动子的序列是taatacgactcactatagg。
5、在其中一些实施例中，所述细胞核启动子选自cmv或cag中的至少一种。
6、本专利技术的第二个方面，是提供一种胞质表达质粒patc3p3cag，其为表达质粒中插入有任一种上述胞质表达系统。
7、所述胞质表达质粒patc3p3cag，是携带双功能t7 rnap的胞质表达系统(c3p3)，且在在t7 rnap编码框的上游与细胞核启动子的下游之间插入有t7启动子的序列。
8、本专利技术的第三个方面，是提供了所述胞质表达质粒patc3p3cag的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9、s1、获得携带t7启动子和hdvrz-t7终止子片段的框架序列，所述框架序列如seqid no:1所示；
10、s2、获得携带cag启动子编码基因的片段1，所述片段1的序列如seq id no:3所示，与所述框架序列通过重组连接，获得连接片段s2；
11、s3、构建patc3p3cag质粒：获得携带np868r编码基因的片段2，所述片段2的序列如seq id no:4所示，将所述连接片段s2与所述片段2通过重组连接，重组连接产物转化感受态细胞，培养过夜，获得patc3p3cag质粒。
12、在其中一些实施例中，s1中包括以下步骤：以携带t7启动子和“hdvrz-t7终止子片段的质粒为模板，进行pcr扩增，所述扩增引物的序列如seq id no:8、seq id no:9所示，获得扩增产物；将如seq id no:2所示的t7rnap编码基因重组连接，转化到感受态细胞，培养，酶切，即得所述框架序列。
13、在其中一些实施例中，上述步骤s2中的cag启动子编码基因的片段序列如seq idno:3所示，所述cag启动子编码基因的片段以pcag-puro-egfp质粒为模板pcr扩增得到，所用引物对序列如seq id no:10、seq id no:11所示。
14、在其中一些实施例中，上述步骤s3中的np868r编码基因的片段序列如seq id no:4所示，所述np868r编码基因的片段以puc57-np868r质粒为模板pcr扩增得到，所用引物对序列如seq id no:12、seq id no:13所示。
15、本专利技术的第四个方面，是提供上述任一项所述的胞质表达系统或胞质表达质粒patc3p3cag在细胞质中进行外源基因中的应用，
16、或提供上述任一项所述的胞质表达系统或胞质表达质粒patc3p3cag在细胞质中增强表达外源蛋白中的应用。
17、本专利技术的第五个方面，是提供一种在细胞质中增强表达外源蛋白的方法，包括将上述胞质表达质粒patc3p3cag与外源蛋白的表达载体共转染至表达细胞，在表达细胞的细胞质中进行外源细胞的转录和表达。
18、本专利技术所述胞质表达系统通过巧妙地在t7 rnap编码框的上游与细胞核启动子的下游之间插入有t7启动子的序列，由此为t7 rnap的胞质表达系统引入自扩增机制，借助细胞核启动子，如cmv，cag等驱动t7 rnap的胞质表达系统的表达。我们发现，t7 rnap的胞质表达系统对胞质中带有t7启动子的外源蛋白表达载体进行转录产生携带5'帽子结构的mrna，能够实现对外源蛋白表达促进；同时，t7 rnap的胞质表达系统还可识别胞质中存在的自身表达载体中的t7启动子，以实现对自身表达载体进行正反馈的转录和表达，从而提高其表达量，继而显著地增强外源蛋白的表达水平。
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1.一种胞质表达系统，其特征在于，在T7 RNAP的胞质表达系统中的T7RNAP编码框的上游与细胞核启动子的下游之间插入有T7启动子的序列。
2.根据权利要求1所述的胞质表达系统，其特征在于，所述胞质表达系统从5’至3’依次包括以下元件的序列：细胞核启动子，T7启动子，非洲猪瘟病毒的加帽酶，T7 RNA聚合酶，bGHpA，poly A尾，核酶，T7终止子。
3.根据权利要求2所述的胞质表达系统，所述细胞核启动子选自CMV或CAG中的至少一种。
4.一种胞质表达质粒patC3P3cag，其特征在于，所述胞质表达质粒patC3P3cag为表达质粒中插入有权利要求1-3任一项所述的胞质表达系统。
5.权利要求4所述的胞质表达质粒patC3P3cag的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤包括如下：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S1中包括以下步骤：以携带T7启动子和“HDVRz-T7终止子片段的质粒为模板，进行PCR扩增，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示，获得扩增产物；将如
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞是Top10感受态细胞。
8.权利要求1-3任一项所述的胞质表达系统或权利要求4所述的胞质表达质粒patC3P3cag在细胞质中进行外源基因中的应用。
9.权利要求1-3任一项所述的胞质表达系统或权利要求4所述的胞质表达质粒patC3P3cag在细胞质中增强表达外源蛋白中的应用。
10.一种在细胞质中增强表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括将权利要求4所述胞质表达质粒patC3P3cag与外源蛋白的表达载体共转染至表达细胞，在表达细胞的细胞质中进行外源细胞的转录和表达。
...【技术特征摘要】
1.一种胞质表达系统，其特征在于，在t7 rnap的胞质表达系统中的t7rnap编码框的上游与细胞核启动子的下游之间插入有t7启动子的序列。
2.根据权利要求1所述的胞质表达系统，其特征在于，所述胞质表达系统从5’至3’依次包括以下元件的序列：细胞核启动子，t7启动子，非洲猪瘟病毒的加帽酶，t7 rna聚合酶，bghpa，poly a尾，核酶，t7终止子。
3.根据权利要求2所述的胞质表达系统，所述细胞核启动子选自cmv或cag中的至少一种。
4.一种胞质表达质粒patc3p3cag，其特征在于，所述胞质表达质粒patc3p3cag为表达质粒中插入有权利要求1-3任一项所述的胞质表达系统。
5.权利要求4所述的胞质表达质粒patc3p3cag的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤包括如下：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，s1中包括以下步骤：以携带t7启动...
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