【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法。
技术介绍
1、由于高密度养殖模式、环境恶化等，青蟹的疾病爆发频繁，给青蟹养殖业带来了巨大的损失。目前在青蟹免疫研究中仍然缺乏有效的过表达手段，一定程度上阻碍了青蟹病害的防治。
2、细菌胞外囊泡是一种直径为30-150nm的致密的磷脂双分子层膜性囊泡，在细胞间信息交流、物质递送发挥重要作用，与非病毒载体中的脂质体相似，但功能和结构更为复杂，与真核生物中的外泌体类似。作为天然的纳米颗粒载体，具有低免疫原性、无内毒素、渗透性好等优势，目前是最具有潜力的药物递送载体，适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸和基因治疗剂。
3、目前外源基因导入主要有物理、化学以及生物方法。物理方法包括电穿孔、基因枪、显微注射等；化学方法包括磷酸钙、纳米粒子介导等方法；生物方法有农杆菌转化法和病毒转染法。各类外源基因导入技术在应用过程中具备各自的优缺点。显微注射技术成功率高，但其操作复杂、实验进程长、对设备及操作要求高；电穿孔技术通常采用病毒和脂质体进行转染，然而病毒介导的转染适用性受限，且安全性较差；而脂质体转染对细胞毒性大。
4、拟穴青蟹作为开管式循环的甲壳类动物，尚且没有可供使用的成熟细胞系，无法利用上述技术将外源基因直接导入拟穴青蟹体细胞内进行过表达。
5、因此，针对上述问题提出一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种基于细菌
2、本专利技术提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，包括以下步骤：
3、s1、构建克隆载体，筛选阳性克隆并提取质粒；
4、s2、通过工程菌诱导细菌胞外囊泡分泌，并通过超滤法提取所述细菌胞外囊泡；
5、s3、将所述细菌胞外囊泡与所述质粒、电转缓冲液混匀后电击，制得电转染体系；
6、s4、将所述电转染体系注射到拟穴青蟹体内进行蛋白过表达。
7、可选地，步骤s1中所述质粒中包含外源基因。
8、可选地，步骤s2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
9、可选地，步骤s2中所述超滤法包括以下步骤：
10、6000×g离心10min，得到上清液一及沉淀；
11、加入pbs重悬沉淀并进行超声破碎，制得破碎液；
12、将破碎液于6000×g，离心30min得上清液二；
13、将上清液一与上清液二混合并通过0.22μm滤膜过滤后得到滤液；
14、将滤液加入100kda的超滤管中，2000×g离心10min；
15、将上一步离心得到的上清液加入100kda的超滤管中，2000×g离心10min；重复此步骤至离心得到的上清液体积浓缩至1ml，制得到细菌胞外囊泡浓缩液。
16、可选地，步骤s3中所述电击的参数为：单次脉冲的电压为400-600v；单次脉冲的时间为1-3ms；共1-2次脉冲。
17、可选地，步骤s3中所述电转染体系的体积为150-200μl。
18、可选地，步骤s3中所述电转染体系中细菌胞外囊泡的颗粒数目为(1.0～5.0)×1010。
19、另一方面，本专利技术提供的方法可应用于无细胞系生物体内构建蛋白过表达技术。
20、本专利技术具备的有益效果包括：
21、(1)本专利技术提供的方法能够简单、高效和经济地生产携带生物活性物质的细菌胞外囊泡；
22、(2)本专利技术提供的方法中制得的胞外囊泡可以被受体细胞所摄取发挥生物活性物质的作用，且本专利技术所使用的胞外囊泡渗透性好，内毒素低，无显著免疫排斥反应；
23、(3)本专利技术提供的电转染体系及其参数，能够稳定地将质粒转入拟穴青蟹外泌体中，并且在拟穴青蟹体内进行蛋白表达，可为无细胞系生物的蛋白过表达体系构建提供新思路。
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1.一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述质粒中包含外源基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述超滤法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电击的参数为：单次脉冲的电压为400-600V；单次脉冲的时间为1-3ms；共1-2次脉冲。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电转染体系的体积为150-200μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电转染体系中细菌胞外囊泡的颗粒数目为(1-5)×1010。
8.如权利要求1所述的方法在1-7任一项在无细胞系生物体内构建蛋白过表达技术中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述质粒中包含外源基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中所述超滤法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚燚，易程，胡航，赵鑫珊，孙明铭，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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