【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种六种对虾病毒多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒。
技术介绍
1、背景一：
2、斑节对虾杆状病毒(monodon baculovirus,mbv)又称斑节对虾单囊核型多角体病毒，属于杆状病毒科(baculoviridae)(rajendran et al.,2012)。它是一种杆状、有包膜的双链dna病毒，杆状包膜病毒颗粒长265～324nm，直径42～77nm。该病毒基因组大小在80～160kb之间，编码一个53kda的主要多角体多肽和两个次要的47kda和49kda多肽(rajendranet al.,2012；tandel et al.,2017)。mbv病毒主要侵染虾肝胰小管上皮细胞和前中肠上皮细胞，并在细胞核内复制，受感染的细胞核变大，染色质减少和边缘化，导致上皮细胞坏死(rajendran et al.,2021)。
3、桃拉综合征是由桃拉病毒(taura syndrome virus,tsv)引起的危害较为严重的对虾急性传染病之一，是国际兽疫局(office international des epizooties,oie)认定的必须申报的对虾急性传染病(chakrobortty et al.,2020)。
4、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,wssv)属于线头病毒科(nimaviridae)，白斑病毒属(whispovirus)，为环状双链dna病毒，类杆状，无包埋体，长约210～380nm，是一种
5、mbv、tsv和wssv是几种分布较广，对养殖产业造成较大经济损失的对虾病毒(chakrobortty et al.,2020；lightner and redman,1985b)。其中wssv引起的白斑综合症是对虾养殖产业最严重的对虾疾病。mbv是对虾中首次被报道的病毒，与其它病毒混合感染情况的存在会使对虾的死亡率提高(tang and lightner,2011；姚洪等,2016)，且增大检测难度。对水产养殖业而言，及时发现传染病对于预测、预防和控制潜在的爆发至关重要。
6、实时荧光定量pcr是一种高效稳定的检测方法，检测灵敏度高，满足在疾病早期的检测要求，目前已经在病原诊断中的得到广泛应用(陈信忠等,2009)。
7、但是传统的单重实时荧光定量pcr对每个病毒都需要通过pcr单独检查，需要耗费更多的时间和试剂(方成俊等,2013)。而多重实荧光定量pcr方法可以同时扩增多个靶标，克服单重实时荧光定量pcr检测仅扩增一对引物的缺点，同时也降低检测成本，被证明是一种高效快速的方法。并且多重荧光定量pcr方法减少了加样次数，可以避免样品间交叉污染风险(饶品彬,2014)。此前已有针对tsv和wssv多重实时荧光定量pcr的报导报道，但灵敏度不高(xie et al.,2008)。
8、背景二：
9、肝胰细小病毒(hpv)、黄头病毒(yhv)、传染性皮下和造血坏死病毒(ihhnv)是对虾养殖产业中常见的几种病毒。
10、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hernatopoieticnecrosis virus,ihhnv)是已知对虾病毒中的最小病毒。
11、肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic parvovirus,hpv)是养殖对虾易感染主要病原体之一，该病毒为单链dna病毒，有包涵体，直径约22nm，无囊膜，呈二十面体结构，在大小、形状和基因组结构上与ihhnv相似，属细小病毒科(parvoviride)(lightner et al.,1994)。
12、黄头病毒(yellow head virus,yhv)属于杆套病毒科(roniviridae)头甲病毒属(okavirus)，是有包涵体的杆状单链rna病毒，yhv基因组全长26662nt(nadala et al.,1997)。yhv主要感染幼年早期至晚期的虾，主要特征是先迅速消耗饲料，然后停止进食，患病虾聚集在池塘边缘，死亡速度加快。因患病虾底层肝胰脏变色导致头胸呈白色或淡黄色外观，将其命名为黄头病(boonyaratpalin et al.,2009)。
13、hpv可感染几种野生和培养的对虾属物种，并在全球范围内分布(flegel et al.,2004；sukhumsirichart et al.,2006)。并且hpv可在养殖过程中造成相当大的损失，而没有任何明显的临床表现(lightner and redman,1985)。hpv和ihhnv同属细小病毒科，病毒基因组同源性较高，且两种病毒还存在混合感染的情况(dhar et al.,2019)。因此，需要建立一种灵敏诊断hpv、yhv和ihhnv三种病毒感染的检测方法，从而可以在早期对对虾幼虫感染情况进行诊断，及时采取措施。
14、自80年代pcr技术被开发以后，由于其快速，高效，准确率高等优点，迅速被应用于病毒检测(lightner,2011；yang et al.,2006)。
15、多重pcr通过在一个反应体系中加入多对引物，可以同时扩增多个模板，缩短了pcr扩增的时间，提高了检测效率。目前已经有关于普通多重pcr检测对虾病毒的报道(jeeva et al.,2014；kanjanasopa et al.,2015；xie et al.,2007b；乌日琴等,2011)，但是普通多重pcr的方法灵敏度普遍不高，无法满足在病毒流行早期检测的要求，而多重荧光定量pcr方法则只有关于其中两种病毒而没有同时针对这三种病毒的方法报道(dhar etal.,2019；panichareon et al.,2011)。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种高覆盖率、高灵敏度和特异性的多重荧光定量pcr快速诊断试剂盒，可以分别同时检测和区分mbv、tsv和wssv三种对虾病毒以及同时检测和区分hpv、yhv和ihhnv三种对虾病毒。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种同时特异检测三种对虾病毒感染的多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒：
3、方案一、三种对虾病毒为mbv、tsv、wssv，所用引物为：
4、mbv-f：gccatcaaatgacgaaagagg，
5、mbv-r：gggacgccaatgaggagac；
6、tsv-f：cctgaggagcccactttttc，
7、tsv-r：agtctgtgccttccaccagt；
8、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时特异检测三种对虾病毒感染的多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括荧光定量PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和定量PCR标准品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
4.利用如上述权利要求1～3任一的试剂盒进行的多重实时荧光定量PCR快速诊断方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的多重实时荧光定量PCR快速诊断方法，其特征在于：
6.利用如上述权利要求1～3任一的试剂盒进行的多重实时荧光定量PCR快速诊断方法，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的多重实时荧光定量PCR快速诊断方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种同时特异检测三种对虾病毒感染的多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括荧光定量pcr反应液、阳性对照品、阴性对照品和定量pcr标准品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
4.利用如上述权利要求1～3任一的试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜永厚，申艳梅，王佩，胡成洁，刘芹，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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