【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于从真菌和/或植物或其部分获得含有小rna(srna)的提取物的方法。所述srna可包含单链rna(ssrna)和/或具有部分对齐的单链rna和/或特别地还包含具有或不具有(完整)序列互补性的双链rna(dsrna)。获得的srna可用于制备或修饰各种产物，例如从第一产品制备第二产品，例如在营养保健品、药妆品或制药领域。
技术介绍
1、现有技术包含用于从(生物)样品例如真菌或植物样品中分离小rna的方法的各种实例，且当前有各种试剂盒可用于从(生物)样品例如真菌或植物样品中分离小rna分子的。
2、大多数已知用于从植物或真菌中分离小rna的方法已开发用于分析范围，通常不适用于从真菌和/或植物中高效分离安全的、可用于食品工业的小rna分子。因此，它们通常用于少量(毫克或克)的组织，并且通常旨在提供组织中存在的全谱rna种类。这通常涉及使用化学和物理策略来防止rna酶介导的一些rna类型的降解，最重要的是mrna和其他ssrna。用于防止样品中rna酶活性的策略包括使用有毒的溶剂药剂(即苯酚)、溶剂(氯仿)或离液剂(tfa、pca和盐酸胍)。所有这些方法都很麻烦，并且由于需要相分离、离心和/或使用(和处置)昂贵或有毒的溶剂或试剂，不适合放大或工业化。
3、方便的现有技术方法通常包括使用固体支持物来结合rna。
4、在wo 2017/072285中，申请人披露了从真菌和/或植物样品中提取小rna分子的方法，需要将获得的溶液加载到能够选择性结合小rna的固体支持物上的步骤。事实上，当
5、现在，申请人意外地发现并反复证明，在本文披露的工艺条件下，不需要或不强制使用固体支持物(例如二氧化硅珠)来结合rna分子的步骤。申请人还证明，如果没有该步骤，提取方法在小rna产率方面的性能也不受影响甚至得到改善。此外，在不进行使用固体支持物结合rna分子的步骤时，该方法变得更易处理、耗时更短且成本更低。
6、因此，改进的方法还具有上文针对wo 2017/072285中方法所披露的优点。
7、因此，本专利技术的一个目的是提供用于分别纯化和获得具有一种或多种所述所需特征的srna的这种有利方法。
8、将参考以下附图通过非限制性实例来说明本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种用于从真菌和/或植物或其部分获得含有小rna(srna)的提取物的方法，所述提取物的特征在于富含srna分子的部分，所述srna分子具有少于200个核苷酸或碱基对(bp)，其中所述方法包括：a)至少一个如下步骤：用碳酸氢盐溶液处理所述真菌或植物或其部分以获得液相，所述液相包含含有小rna的提取物或由其组成，条件是所述方法不采用用于结合小rna分子的固体支持物。
2、优选地，所述方法进一步包括：b’)至少一个如下步骤：收集步骤a)中所述液相并将其浓缩以获得浓缩的含有小rna的提取物；和/或b)至少一个如下步骤：收集步骤a)中所述液相或步骤b’)中所述浓缩的含有小rna的提取物并向步骤a)中所述液相或向步骤b’)中所述浓缩的含有小rna的提取物添加醇溶液，以使所述含有小rna的提取物沉淀；以及任选地以下步骤：c)收集步骤b’)中所述浓缩的含有小rna的提取物或步骤b)中沉淀的含有srna的提取物。
3、根据优选的实施例，这些srna分子的特征在于少于100个核苷酸、更优选地少于30个核苷酸或bp；还更优选地，所述srna具有19-24个核苷酸或bp、还更优选地21-24个核苷酸或bp。
4、优选地，这些srna分子为多达300mg/kg加工的植物或真菌、优选地多达250mg/kg加工的植物或真菌、更优选地多达200mg/kg加工的植物或真菌、还更优选地多达100mg/kg加工的植物或真菌。
5、根据优选的实施例，碳酸氢盐溶液选自由以下组成的组：碳酸氢钠、碳酸氢钾及其混合物。
6、优选地，所述碳酸氢盐溶液以5至100mm、优选地10至100mm或优选地30至100mm或优选地5至50mm、更优选地5至30mm、还更优选地5至10mm或10至30mm范围的浓度使用。更优选地，所述碳酸氢盐溶液进一步包含盐、优选地nacl，其中所述盐、优选地nacl以优选地100至500mm范围的浓度存在。
7、根据优选的实施例，所述碳酸氢盐溶液显示出7至9.5范围的ph。
8、根据优选的实施例，所述真菌/植物与所述碳酸氢盐溶液之间的比率在1:1至1:4之间。
9、根据优选的实施例，所述步骤a)在50℃至100℃、优选地50℃至80℃、更优选地50℃至70℃、甚至更优选地60℃至70℃范围的温度下进行。根据优选的实施例，所述步骤a)在45℃或50℃至100℃、优选地45℃至85℃或50℃至80℃、更优选地50℃至70℃、甚至更优选地60℃至70℃范围的温度下进行。
10、更优选地，步骤a)进行多达20小时、优选地多达16小时、更优选地多达10小时、还更优选地多达6小时或更少。
11、根据优选的实施例，出于此目的，通过使用本领域已知的任何手段来收集液相，优选地通过过滤、优选地使用具有尺寸10-50μm的孔的过滤器进行收集。
12、根据优选的实施例，所述醇选自异丙醇和/或乙醇，并且其优选地以选自以下的最终浓度使用：98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％v/v。优选地液体部分:醇的比率选自：0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1。
13、本专利技术的另一方面涉及一种产品，其可通过本文披露的任何过程或方法获得。
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1.一种用于从真菌和/或植物或其部分获得含有小RNA(sRNA)的提取物的方法，所述提取物的特征在于富含sRNA分子的部分，所述sRNA分子具有少于200个核苷酸或碱基对(bp)，其中所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述sRNA分子的特征在于少于100个核苷酸、更优选地少于30个核苷酸或bp；还更优选地，所述sRNA具有19-24个核苷酸或bp、还更优选地21-24个核苷酸或bp。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述sRNA分子为多达300mg/Kg加工的植物或真菌、优选地多达250mg/Kg加工的植物或真菌、更优选地多达200mg/Kg加工的植物或真菌、还更优选地多达100mg/Kg加工的植物或真菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液选自由以下组成的组：碳酸氢钠、碳酸氢钾及其混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液以5至100mM、优选地10至100mM或优选地30至1
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液进一步包含盐、优选地NaCl，其中所述盐、优选地NaCl以优选地100至500mM范围的浓度存在。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液显示出7至9.5范围的pH。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述真菌/植物与所述碳酸氢盐溶液之间的比率在1:1至1:4之间。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤a)在45℃或50℃至100℃，优选地45℃至85℃、50℃至80℃，更优选地50℃至70℃，甚至更优选地60℃至70℃范围的温度下进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤a)进行多达20小时、优选地多达16小时、更优选地多达10小时、还更优选地多达6小时或更少。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中出于此目的，通过使用本领域已知的任何手段来收集所述液相，优选地通过过滤、优选地使用具有尺寸10-50μm的孔的过滤器进行收集。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述醇选自异丙醇和/或乙醇，并且其优选地以选自以下的最终浓度使用：98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％v/v。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中液体部分:醇的比率选自：0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1。
15.一种产品，其可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于从真菌和/或植物或其部分获得含有小rna(srna)的提取物的方法，所述提取物的特征在于富含srna分子的部分，所述srna分子具有少于200个核苷酸或碱基对(bp)，其中所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述srna分子的特征在于少于100个核苷酸、更优选地少于30个核苷酸或bp；还更优选地，所述srna具有19-24个核苷酸或bp、还更优选地21-24个核苷酸或bp。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述srna分子为多达300mg/kg加工的植物或真菌、优选地多达250mg/kg加工的植物或真菌、更优选地多达200mg/kg加工的植物或真菌、还更优选地多达100mg/kg加工的植物或真菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液选自由以下组成的组：碳酸氢钠、碳酸氢钾及其混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液以5至100mm、优选地10至100mm或优选地30至100mm或优选地5至50mm、更优选地5至30mm、还更优选地5至10mm或10至30mm范围的浓度使用。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述碳酸氢盐溶液进一步包含盐、优选地nacl，其中所述盐、优选地nacl以优选地100至500mm范围的浓度存在。
【专利技术属性】
技术研发人员：R·维奥拉，
申请(专利权)人：米尔纳格林有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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