【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种肿瘤细胞稳定液及其制备方法和应用。
技术介绍
1、循环肿瘤细胞(ctc，circulatingtumor cell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此早期发现血液中的ctc，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。
2、ctc的体外培养是对其进行功能分析，研究肿瘤转移和耐药机制的必要手段，而相关的研究结果反过来又可以推动ctc检测技术的改进和提高。但是体外培养并不是一件容易的事情，即使是人类原发肿瘤也只有在极少数情况下才能够建立起可以连续传代的细胞系。
3、ctc的体外培养是十分具有挑战性的，因为ctc体外培养的建立必须同时满足两个前提条件。首先是要有合适的技术能够富集到足够数量的活ctc。其次，富集到的ctc活性需要最大程度保持稳定，能够保持一定活性并在适当的培养条件下正常增殖生长。
4、目前用于捕获和富集ctc的方法大多数需要依赖抗体通过免疫捕获的方式富集，存在少数不利用免疫捕获技术富集ctc的技术，但依然需要对细胞进行离心、重悬甚至洗脱等步骤。以上步骤一般性会伴随使用磷酸盐缓冲液或生理盐水等缓冲液。但有文献指出，磷酸盐缓冲液在稀释样本过程中可能会降低细胞活力，并会与某些金属离子形成络合物等。并且ctc分选和富集中，细胞在体外操作不可避免地会在体外短期保存，细胞会处
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种肿瘤细胞稳定液，对于解决循环肿瘤细胞样本体外处理过程中造成的活性下降和对细胞状态的破坏有重要现实意义。
2、在第一方面，本专利技术提供了一种肿瘤细胞稳定液，包括缓冲成分、营养成分和抗氧化成分，其中，所述营养成分包括蛋氨酸、l-谷氨酰胺、牛血清白蛋白和丙酮酸钠，所述抗氧化成分包括β-巯基乙醇。
3、本专利技术中，对于稳定成分的选择，其中蛋氨酸、l-谷氨酰胺、血清白蛋白、丙酮酸钠等成分可有效满足循环肿瘤细胞的短期营养需求；对于抗氧化成分的选择，β-巯基乙醇可有效中和细胞产生的羟基自由基等氧化物质，实现抗氧化作用，保护循环肿瘤细胞活性。
4、在一些实施方式中，所述缓冲成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、nacl、na2hpo4、kcl和naoh。
5、在一些实施方式中，所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白，例如包括小牛血清白蛋白和/或胎牛血清白蛋白。
6、在一些实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液包括5-50mg/l(例如为5mg/l、10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l或50mg/l)蛋氨酸、0.1-1g/l(例如为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l或1g/l)l-谷氨酰胺、0.5-10g/l(例如为1g/l、2g/l、4g/l、6g/l、8g/l或10g/l)牛血清白蛋白、0.1-1g/l(例如为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l或1g/l)丙酮酸钠和0.5-1000mg/l(例如为0.6mg/l、0.8mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、70mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l、700mg/l或1000mg/l)β-巯基乙醇。
7、在一些实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液包括5-20mg/l蛋氨酸、0.1-.5g/l l-谷氨酰胺、0.5-10g/l牛血清白蛋白、0.1-0.5g/l丙酮酸钠和2-100mg/lβ-巯基乙醇。
8、在一些优选实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液包括10-20mg/l蛋氨酸、0.2-0.4g/ll-谷氨酰胺、0.5-2g/l牛血清白蛋白、0.1-0.3g/l丙酮酸钠和5-20mg/lβ-巯基乙醇。
9、在一些实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液包括1-10g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1-10g/lnacl、0.1-1g/l na2hpo4·2h2o、0.1-1g/l kcl和0.1-1g/l naoh。
10、在一些实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液还包括溶剂。
11、在一些实施方式中，所述溶剂包括水，优选为去离子水。
12、在一些实施方式中，所述循环肿瘤细胞稳定液的ph在7.0-7.8之间。
13、在一些具体实施方式中，所述肿瘤细胞稳定液包括如下质量浓度的组分或由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-10g/l、nacl 1-10g/l、na2hpo4·2h2o 0.1-1g/l、kcl0.1-1g/l、naoh 0.1-1g/l、蛋氨酸5-50mg/l、l-谷氨酰胺0.1-1g/l、牛血清白蛋白0.5-10g/l、丙酮酸钠0.1-1g/l、β-巯基乙醇1-20mg/l，溶剂为去离子水。稳定液最终ph稳定在7.0-7.8之间。
14、在第二方面，本专利技术提供了一种肿瘤细胞稳定液的制备方法，包括将含有所述缓冲成分的溶液与含有所述营养成分和所述抗氧化成分的溶液混合得到。
15、在第三方面，本专利技术提供了第一方面所述的肿瘤细胞稳定液或第二方面所述的制备方法得到的肿瘤细胞稳定液在肿瘤细胞的分离、富集或体外培养中的应用。
16、优选地，所述肿瘤细胞包括但不限于：各癌种循环肿瘤细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、淋巴癌细胞、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌等中的一种或多种。
17、在第四方面，本专利技术提供了一种循环肿瘤细胞的分离方法，包括将体液样本与红细胞沉降液和第一方面所述的肿瘤细胞稳定液进行混合，静置后从上层分离得到循环肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述体液样本包括但不限于：血液、腹腔液或淋巴液等。
18、在一些实施方式中，所述血液样本、红细胞沉降液和肿瘤细胞稳定液的混合体积比为(1-2)：(1-2)：(1-2)，优选为1:1:1。
19、在一些实施方式中，所述红细胞沉降液包括葡聚糖、氯化钠和无菌水。
20、在一些实施方式中，所述静置的温度为20-35℃。
21、在一些实施方式中，所述静置的时间为30-40min。
22、在一些实施方式中，所述方法还包括使用所述肿瘤细胞稳定液对分离得到的循环肿瘤细胞进行重悬。
23、本专利技术提供的循环肿瘤细胞稳定液用于常规血液样本预处理过程中，以及循环肿瘤细胞分选和富集过程中，充当缓冲液使用。
24、在一些具体实施方式中，所述方法包括新鲜血液样本使用红细胞沉降法进行预处理，取出新鲜的抗凝血、红细胞沉降液、肿瘤细胞稳定液三种试剂加入到同一试管中，且添加比例为1:1:1，充分混匀。室温下静置30-40min后，可见红细胞沉入试管底部，上层为外本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤细胞稳定液，包括缓冲成分、营养成分和抗氧化成分，其中，所述营养成分包括蛋氨酸、L-谷氨酰胺、血清白蛋白和丙酮酸钠，所述抗氧化成分包括β-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述缓冲成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaCl、Na2HPO4、KCl和NaOH；和/或
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述肿瘤细胞稳定液包括5-50mg/L蛋氨酸、0.1-1g/L L-谷氨酰胺、0.5-10g/L牛血清白蛋白、0.1-1g/L丙酮酸钠和0.5-1000mg/Lβ-巯基乙醇；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述循环肿瘤细胞稳定液包括1-10g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1-10g/L NaCl、0.1-1g/L Na2HPO4·2H2O、0.1-1g/LKCl和0.1-1g/L NaOH。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述肿瘤细胞稳定液还包括溶剂；
6.一种肿瘤细胞稳定液的制备方法，包括将含有权利要求
7.权利要求1-5中任一项所述的肿瘤细胞稳定液或权利要求6所述的制备方法得到的肿瘤细胞稳定液在肿瘤细胞的分离、富集或体外培养中的应用；
8.一种循环肿瘤细胞的分离方法，包括将体液样本与红细胞沉降液和权利要求1-5中任一项所述的肿瘤细胞稳定液进行混合，静置后从上层分离得到循环肿瘤细胞；
9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述血液样本、红细胞沉降液和肿瘤细胞稳定液的混合体积比为(1-2)：(1-2)：(1-2)；和/或
10.根据权利要求8或9所述的分离方法，其特征在于，所述方法还包括使用所述肿瘤细胞稳定液对分离得到的循环肿瘤细胞进行重悬。
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞稳定液，包括缓冲成分、营养成分和抗氧化成分，其中，所述营养成分包括蛋氨酸、l-谷氨酰胺、血清白蛋白和丙酮酸钠，所述抗氧化成分包括β-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述缓冲成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、nacl、na2hpo4、kcl和naoh；和/或
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述肿瘤细胞稳定液包括5-50mg/l蛋氨酸、0.1-1g/l l-谷氨酰胺、0.5-10g/l牛血清白蛋白、0.1-1g/l丙酮酸钠和0.5-1000mg/lβ-巯基乙醇；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肿瘤细胞稳定液，其特征在于，所述循环肿瘤细胞稳定液包括1-10g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1-10g/l nacl、0.1-1g/l na2hpo4·2h2o、0.1-1g/lkcl和0.1-1g/l naoh。
5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：江忠运，刘荣，赵岩，
申请(专利权)人：苏州莱博睿思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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