【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一种杨树组培苗内生菌的分离鉴定及计数方法。
技术介绍
1、植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在健康植物组织或器官内，并且没有引起宿主植物发生明显病害的一类微生物群，主要包括内生真菌、内生菌、内生放线菌。它们中不仅有互惠共利的和中性的内共生微生物，也有一些潜伏在宿主体内的病原微生物，当寄主遇到恶劣的环境或外界微生物干扰时，病原微生物能够重新活动，引起寄主产生病害。在组织培养过程中，常规消毒方法很难完全除去植物内生菌。因此，植物内生菌也因此成为影响组培苗培育的关键障碍。
2、内生菌不仅具有诱导次级代谢产物合成、促进活性成分累积的作用，同时具有促进植物生长、提高农作物产量和植物对生物和非生物胁迫的抗性等功能，它在农业、医药业和其他工业中都具有一定的潜在应用。
3、杨树(populus spp.)是杨柳科(salicaceae)杨属树种的统称，是世界上适应性最强、分布最广的树种，且杨树生长速度快、易繁殖，长期以来，杨树一直被广泛地应用于生态环境治理、农林业以及工业。此外，杨树还是公认的生产生物燃料的理想作物以及生理生态研究的模式树种，是进行基因转化获得安全转基因新品种的理想受体。
4、目前，国内外对于杨树内生菌的报道多集中于露地栽培的大树茎干或根系内生菌的研究，现有技术中也有公开关于植物内生菌的分离方法。例如，申请号为：202211418505.0的中国专利技术专利公开了一种分离获得植物内生菌的方法，是经过植物预处理、表面消毒、内生菌的孵育、内生菌的分离纯化等
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，用于分离杨树组培苗内生菌。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种杨树组培苗内生菌的计数方法，用于分离出的杨树组培苗内生菌的计数。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，包括：
4、以山新杨组培苗3个不同器官组织为样品，采用组织匀浆法分离纯化得到山新杨组培苗的内生菌株；采用电镜观察和革兰氏染色法对分离纯化得到的内生菌株进行形态鉴定，最终鉴定出3株单一内生菌株sx-1、sx-3、sx-18；将鉴定得到的单一内生菌株sx-1、sx-3、sx-18进行分子鉴定，最终将所述菌株sx-1鉴定为乙酰微小杆菌；将所述菌株sx-3鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌；将所述菌株sx-18鉴定为类芽孢杆菌。
5、所述内生菌株的分离方法步骤为：分别称取1g山新杨组培苗3个不同器官组织的样品置于无菌研钵中，加入9ml 8.5g/l的生理盐水，研磨成匀浆；将匀浆静置5分钟后，分别取少量上清按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的比例进行稀释；分别取100μl稀释液用平板涂布法涂布于lb固体培养基上，每个梯度涂3个重复，置于37℃培养箱中倒置培养48h，每天观察平板上菌落生长状况；选取菌落数在30-300个的相应的稀释梯度的平板进行计数，并记录不同培养基平板中菌落形态；挑取菌落形态、颜色及其生长速度一致的单菌落，采用平板划线法不断纯化单菌落直至形成的全部菌落形态一致，即初步分离纯化得到山新杨组培苗的内生菌株。
6、所述内生菌株的形态鉴定方法步骤为：将组织匀浆法分离纯化得到的菌落进行编号，对菌落进行革兰氏染色和电镜观察，将显微镜观察到的形态特征一致的菌株合并为一组，分别编号为sx-1、sx-3、sx-18。
7、所述分子鉴定的进化分析步骤为：以内生菌样本的基因组总dna为模板，使用正向引物：5'-agagtttgatcctggctcag-3'与反向引物：5'-aaggaggtgatccagcc-3'，对内生菌样本的16s rrna序列进行扩增，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的提取质量；将条带清晰的pcr扩增产物送至公司进行测序，测序结果在ncbi中进行blast相似性比对，按序列相似度大于97％的标准选择参考菌株，用mega5.1软件采用邻接法构建系统发育树，最终将所述菌株sx-1鉴定为乙酰微小杆菌；将所述菌株sx-3鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌；将所述菌株sx-18鉴定为类芽孢杆菌。
8、杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，具体步骤包括：
9、1)分别称取1g山新杨组培苗3个不同器官组织的样品置于无菌研钵中，加入9ml8.5g/l的生理盐水，研磨成匀浆；将匀浆静置5分钟后，分别取少量上清按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的比例进行稀释；分别取100μl稀释液用平板涂布法涂布于lb固体培养基上，每个梯度涂3个重复，置于37℃培养箱中倒置培养48h，每天观察平板上菌落生长状况；选取菌落数在30-300个的相应的稀释梯度的平板进行计数，采用每克样品中的活菌数计算公式进行计数；每个稀释度的菌落数应采用3个平板上菌落数的平均值；挑取菌落形态、颜色及其生长速度一致的单菌落，采用平板划线法不断纯化单菌落直至形成的全部菌落形态一致，即初步分离纯化得到山新杨组培苗的内生菌株；
10、2)将组织匀浆法分离纯化得到的菌落进行编号，对菌落进行革兰氏染色和电镜观察，将显微镜观察到的形态特征一致的菌株合并为一组，分别编号为sx-1、sx-3、sx-18；
11、3)根据植物基因组dna提取试剂盒说明书，分别提取编号为sx-1、sx-3、sx-18的内生菌样本的基因组总dna，dna的浓度和纯度采用nanodrop2000测定；以内生菌样本的基因组总dna为模板，使用正向引物：5'-agagtttgatcctggctcag-3'与反向引物：5'-aaggaggtgatccagcc-3'，对内生菌样本的16s rrna序列进行扩增；反应体系为：rtaq酶0.5μl、dntps 2μl、dna模板2μl、10×buffer 2.5μl、上下游引物各1μl、ddh2o补至25μl；pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min；采用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的提取质量，将条带清晰的pcr扩增产物送至公司进行测序，测序结果在ncbi中进行blast相似性比对，按序列相似度大于97％的标准选择参考菌株，用mega5.1软件采用邻接法构建系统发育树，最终将所述菌株sx-1鉴定为乙酰微小杆菌；将所述菌株sx-3鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌；将所述菌株sx-18鉴定为类芽孢杆菌。
12、一种杨树组培苗内生菌的计数方法，包括：
13、分别称取1g山新杨组培苗3个不同器官组织的样品置于无菌研钵中，加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述内生菌株的分离方法步骤为：分别称取1g山新杨组培苗3个不同器官组织的样品置于无菌研钵中，加入9mL 8.5g/L的生理盐水，研磨成匀浆；将匀浆静置5分钟后，分别取少量上清按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的比例进行稀释；分别取100μL稀释液用平板涂布法涂布于LB固体培养基上，每个梯度涂3个重复，置于37℃培养箱中倒置培养48h，每天观察平板上菌落生长状况；选取菌落数在30-300个的相应的稀释梯度的平板进行计数，并记录不同培养基平板中菌落形态；挑取菌落形态、颜色及其生长速度一致的单菌落，采用平板划线法不断纯化单菌落直至形成的全部菌落形态一致，即初步分离纯化得到山新杨组培苗的内生菌株。
3.根据权利要求1所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述内生菌株的形态鉴定方法步骤为：将组织匀浆法分离纯化得到的菌落进行编号，对菌落进行革兰氏染色和电镜观察，将显微镜观察到的形态特征一致的菌株合并为一
4.根据权利要求1所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述分子鉴定的进化分析步骤为：以内生菌样本的基因组总DNA为模板，使用正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与反向引物：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'，对内生菌样本的16SrRNA序列进行扩增，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量；将条带清晰的PCR扩增产物送至公司进行测序，测序结果在NCBI中进行Blast相似性比对，按序列相似度大于97％的标准选择参考菌株，用MEGA5.1软件采用邻接法构建系统发育树，最终将所述菌株SX-1鉴定为乙酰微小杆菌；将所述菌株SX-3鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌；将所述菌株SX-18鉴定为类芽孢杆菌。
5.根据权利要求1-4任一所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，具体步骤包括：
6.一种杨树组培苗内生菌的计数方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的杨树组培苗内生菌的计数方法，其特征在于，所述每克样品中的活菌数计算公式为每克样品中的活菌数(CFU/g)＝(平板菌落数×稀释倍数)/新鲜植物重量。
8.根据权利要求6-7任一所述的杨树组培苗内生菌的计数方法，其特征在于，具体步骤包括：
...【技术特征摘要】
1.一种杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述内生菌株的分离方法步骤为：分别称取1g山新杨组培苗3个不同器官组织的样品置于无菌研钵中，加入9ml 8.5g/l的生理盐水，研磨成匀浆；将匀浆静置5分钟后，分别取少量上清按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的比例进行稀释；分别取100μl稀释液用平板涂布法涂布于lb固体培养基上，每个梯度涂3个重复，置于37℃培养箱中倒置培养48h，每天观察平板上菌落生长状况；选取菌落数在30-300个的相应的稀释梯度的平板进行计数，并记录不同培养基平板中菌落形态；挑取菌落形态、颜色及其生长速度一致的单菌落，采用平板划线法不断纯化单菌落直至形成的全部菌落形态一致，即初步分离纯化得到山新杨组培苗的内生菌株。
3.根据权利要求1所述的杨树组培苗内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述内生菌株的形态鉴定方法步骤为：将组织匀浆法分离纯化得到的菌落进行编号，对菌落进行革兰氏染色和电镜观察，将显微镜观察到的形态特征一致的菌株合并为一组，分别编号为sx-1、sx-3、sx-18。
4.根据权利要求1所述的...
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