【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一株多功能枯草芽孢杆菌及其分离纯化方法与应用。
技术介绍
1、我国畜禽养殖集约化规模逐年扩张，大量而集中的畜禽废物处理成为近年来畜牧业发展及环境方面急需解决的重大问题。发酵床养殖技术的兴起为全方位解决这些问题带来新的可能，微生物发酵床技术是指以木屑、稻壳、秸秆等农业废弃物为原料，利用微生物技术发酵处理畜禽废物，消除氨氮、硫化氢等有害气体，改善养殖环境的一项养殖技术。利用该项技术进行畜牧养殖，可在一定程度上提高畜禽生产性能和饲料利用率，促进健康养殖业可持续发展。同时，发酵后的垫床可作为原料进行微生物菌剂肥料开发，可以基本实现畜禽废物原位发酵、零排放的标准，在节约部分养殖成本的同时实现资源再利用，具有良好的环境效益和经济效益。同时，异位发酵技术也在逐渐成熟，该项技术通过微生物作用，分解利用粪污中的有机质释放生物质热使温度升高，达到有机物快速转换、同时杀灭病原菌的目的，转化为优质有机肥。异位发酵技术是目前畜禽排泄污染治理中普遍采用的一项技术，具有生态环保、资源合理转化的优点。以上两项重要技术中，微生物的使用直接影响到应用效果。
2、目前，基于对微生物畜牧发酵床，特别是反刍类动物发酵床的开发现状，畜牧粪便中纤维素、木质素等物质难以被高效降解，目前市场上普遍使用较多的纤维素、木质素降解菌类多为真菌类，如曲霉、木霉等真菌，但相关菌类在畜牧发酵床上的应用引起自身生长特性等因素收到限制，该类菌株的大量使用会造成畜牧发酵床内微生物群落结构失衡，一定程度上造成其余菌株的生长甚至功能发挥。因而开发对纤维素、木
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一株多功能枯草芽孢杆菌。对纤维素、木质素等物质降解能力突出，兼具较高的淀粉酶活力，是良好的可用于畜牧发酵床的菌株。可以解决目前畜牧粪便中纤维素、木质素等物质难以被高效降解以及造成畜牧发酵床内微生物群落结构失衡的问题。
2、本专利技术另一目的是提供一株多功能枯草芽孢杆菌在用于制备微生物菌剂产品、强降解纤维素功能的生物产品、降解木质素功能的生物产品、淀粉降解功能的生物产品中的应用；所述微生物菌剂用于制备强降解纤维素功能的生物产品或/和降解木质素功能的生物产品或/和淀粉降解功能的生物产品中的应用。
3、本专利技术的还有一目的是提供一株多功能枯草芽孢杆菌的分离纯化方法。
4、本专利技术是通过如下技术方案实现：
5、本专利技术所述的多功能枯草芽孢杆菌在用于制备微生物菌剂产品、强降解纤维素功能的生物产品、降解木质素功能的生物产品、淀粉降解功能的生物产品中的应用。
6、本专利技术所述微生物菌剂包括但不限于：畜牧发酵床、微生物肥料、生防菌剂、植物促生剂。
7、本专利技术所述微生物菌剂可用于制备强降解纤维素功能的生物产品或/和降解木质素功能的生物产品或/和淀粉降解功能的生物产品中的应用。
8、本专利技术所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。
9、本专利技术所述液体微生物菌剂的制备为将所述的枯草芽孢杆菌经过活化后培养得到；所述固体微生物菌剂的制备为将多功能枯草芽孢杆菌经过活化后培养得到液体微生物菌剂，再将液体微生物菌剂干燥后得到。所述干燥可采用喷雾干燥、真空干燥等本领域常规方法，所述的活化培养方法采取本申请的活化培养方法。
10、本专利技术所述的微生物菌剂是枯草芽孢杆菌作为活性成分，还可包含其他菌剂或辅料，例如可将本专利技术所述枯草芽孢杆菌作为活性成分与其他微生物菌剂组成组合物等产品。所述生物制剂的制备方法可采用本领域常规的微生物制剂的制备方法，本专利技术不另做限定。
11、本专利技术所述的一株多功能枯草芽孢杆菌的分离纯化方法，包括如下步骤：
12、(1)样品采集
13、在森林内进行土壤采集，选取不受人类活动干扰的区域，拨开植被下的凋落物，采取土层深度为10～20cm的土壤；
14、(2)采用反复划线法分离纯化菌株
15、去除土壤中落叶等杂物，取1g土壤分别加入已配制好的lb液体培养基中，30℃、180rpm条件下培养3天；分别吸取1ml培养液，稀释10-3、10-4、10-5倍，涂布于相应固体培养上，30℃静置培养3～7天，挑取形态不一的单菌落进行划线纯化，重复纯化操作，至平板上仅存在单一形态的菌株为止；然后用25％甘油悬浮菌体，保存于-80℃；
16、(3)筛选具有纤维素降解功能的菌株
17、①配制cmc-刚果红培养基
18、②活化菌株：控制菌株悬液od600＝1.0
19、吸取2μl接种在平板上，30℃静置培养48h，配制1mg/ml刚果红溶液，倾倒在平板上，浸没平板20min，倒出刚果红溶液，加入等量1mol/l氯化钠溶液，浸没平板15min，倒出氯化钠溶液，观察脱色圈大小；
20、(4)对具备纤维素降解功能的菌株进行木质素降解能力、产淀粉酶能力的活性筛选
21、①木质素降解能力的活性筛选：
22、配制苯胺蓝平板：在已配制好的lb固体培养基中加入100mg苯胺蓝粉末，121℃高压灭菌20min，制备苯胺蓝平板，20ml/皿；
23、吸取菌液2μl接种于苯胺蓝平板，30℃静置培养3天，观察是否具有脱色圈及脱色圈大小情况；
24、②产淀粉酶能力的活性筛选
25、配制淀粉培养基，吸取2μl菌液接种至淀粉培养基，30℃静置培养3天，观察是否出现透明圈及透明圈大小情况。
26、本专利技术所述步骤(3)中配制cmc-刚果红培养基为：羧甲基纤维素钠10g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，硫酸铵2.0g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml,121℃高压灭菌20min，制平板，每皿20ml。
27、本专利技术所述步骤(4)中配制淀粉培养基具体为：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2g，氯化钙0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.5g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min，制平板，20ml/皿。
28、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
29、1.本专利技术分离纯化所得的菌株bacillus subtilis gzuas561008，通过试验表明在成功筛选分离并验证有对应功能的菌株数量，具有强降解相关物质的功能菌株占据总量的比值，侧面突出本专利技术菌株同时具有强纤维素降解、强木质素降解及较高淀粉酶功能的特殊性。可以解决目前畜牧粪便中纤维素、木质素等物质难以被高效降解以及造成畜牧发酵床内微生物群落结构失衡的问题。
30、2.本专利技术分离纯化所得的菌株bacillus subtilis gzuas561008，是经过形态学鉴定和分子鉴定确认的，可用于畜牧发酵床的菌株，在畜牧发酵床中承担一定的降解功能，能够促进畜牧发酵床技术的完善与推广，具有较本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株多功能枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为Bacillussubtilis GZUAS561008，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo.64097。
2.一种如权利要求1所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述多功能枯草芽孢杆菌在用于制备微生物菌剂产品、强降解纤维素功能的生物产品、降解木质素功能的生物产品、淀粉降解功能的生物产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂包括但不限于：畜牧发酵床、微生物肥料、生防菌剂、植物促生剂。
4.根据权利要求2或3任一项所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂可用于制备强降解纤维素功能的生物产品或/和降解木质素功能的生物产品或/和淀粉降解功能的生物产品中的应用。
5.根据权利要求2所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述液体微生物菌剂的制备为将权利
7.一种如权利要求1所述的多功能枯草芽孢杆菌的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中配制CMC-刚果红培养基为：羧甲基纤维素钠10g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，硫酸铵2.0g，琼脂粉18g，蒸馏水1000mL,121℃高压灭菌20min，制平板，每皿20mL。
9.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，配制淀粉培养基具体为：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2g，氯化钙0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min，制平板，20mL/皿。
...【技术特征摘要】
1.一株多功能枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为bacillussubtilis gzuas561008，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmccno.64097。
2.一种如权利要求1所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述多功能枯草芽孢杆菌在用于制备微生物菌剂产品、强降解纤维素功能的生物产品、降解木质素功能的生物产品、淀粉降解功能的生物产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂包括但不限于：畜牧发酵床、微生物肥料、生防菌剂、植物促生剂。
4.根据权利要求2或3任一项所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂可用于制备强降解纤维素功能的生物产品或/和降解木质素功能的生物产品或/和淀粉降解功能的生物产品中的应用。
5.根据权利要求2所述的多功能枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨仕钰，曹秀兰，燕志宏，兰利伟，周静，
申请(专利权)人：贵州煜宏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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