【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及用于使哺乳动物细胞系适应具有减少量的胰岛素样生长因子(igf-1)的细胞培养基的方法以及使用这些细胞生产重组蛋白。
技术介绍
1、生物配制品由于其广泛的应用而在世界范围内被用于多种应用中，诸如治疗和诊断。哺乳动物细胞系是这些生物配制品的主要表达系统，而中国仓鼠卵巢(cho)细胞是主要的细胞工厂。参见lalonde等人，2017,j biotechnol[生物技术杂志]251:128-140。特别是随着生物仿制药的出现，上市速度和成本效益现在比以往任何时候都更重要。
2、制造生物配制品的成本由于它们利用多步工艺的生产的复杂性而非常高昂，该多步工艺涉及选择最佳的细胞系、大量培养生产细胞、以及从细胞收获物中纯化所需的生物配制品。虽然由于对生产的各方面的改进，这些成本正在下降，但作为一线疗法而广泛采用时，其成本仍可能令人望而却步。
3、为了使患者更容易获得生物治疗剂，降低制造过程的商品成本是有吸引力的建议。高昂的成本的一个领域是原料药工艺中使用的细胞培养基。igf-1是通过胰岛素样生长因子/胰岛素受体(igfr/ir)途径的信号传导支持细胞生长的关键蛋白补充物；然而，其构成了培养基原料成本的很大比例。
4、因此，需要降低与从宿主细胞生产重组蛋白相关的成本。实现这一目的的一种方式是通过减少或消除对某些细胞培养基补充物诸如igf-1的需要来降低商品成本。已经通过为细胞培养基补充血小板衍生的生长因子bb，在间充质干细胞中观察到增强的胰岛素样生长因子-1受体(igf-1r)表达。参见美国专
5、仍然存在对igf-1补充需求减少或没有需求并且在对生长和生产率的影响极低的情况下产生重组蛋白的宿主细胞系的需要。此类细胞系将有益于生物配制品的工艺开发。
技术实现思路
1、本披露提供了用于从哺乳动物细胞培养来生产目的蛋白的方法，该方法包括(a)在具有0.05mg/l或更少的胰岛素样生长因子(igf-1)的第二细胞培养基中培养哺乳动物细胞以表达该目的蛋白，其中该哺乳动物细胞已经直接适应了在具有0.03mg/l或更少的igf-1的第一细胞培养基中生长并且包含编码目的蛋白的异源核酸；以及(b)回收通过该哺乳动物细胞生产的目的蛋白。
2、在某些实施例中，第二细胞培养基含有0.03mg/l或更少的igf-1。在某些实施例中，第一细胞培养基不含igf-1。在某些实施例中，第二细胞培养基不含igf-1。
3、在某些实施例中，已经直接适应的哺乳动物细胞具有与尚未直接适应的相同谱系的哺乳动物细胞相当的生长速率。例如，直接适应的哺乳动物细胞可以具有小于30小时的倍增时间，诸如在20至30小时之间。
4、在某些实施例中，采用本文所述的方法，在培养的第10天，所表达的目的蛋白的滴度为至少50mg/l。
5、在某些实施例中，该目的蛋白是抗原结合蛋白。在某些实施例中，目的蛋白选自由单克隆抗体、双特异性t细胞接合子、免疫球蛋白、fc融合蛋白和肽体组成的组。
6、在某些实施例中，哺乳动物细胞培养工艺利用补料分批培养工艺、灌注培养工艺、或其组合。
7、在某些实施例中，通过在含有0.03mg/l或更少的igf-1的无血清培养基中，为至少100l的生物反应器接种至少0.5×106至3.0×106个细胞/ml来建立哺乳动物细胞培养。在本实施例的某些方面，生物反应器为至少500l或至少2000l。
8、在某些实施例中，这些哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在某些实施例中，这些cho细胞缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr-)或是谷氨酰胺合成酶敲除(gsko)型。
9、在某些实施例中，将回收的目的蛋白纯化并配制成药学上可接受的配制品。
10、本披露还提供了使用本文所述的方法制备的纯化的、配制的目的蛋白。
11、本披露还提供了用于使哺乳动物细胞直接适应igf-培养基的方法，该方法包括：a)在包含0.03mg/l或更少的igf-1的细胞培养基中培养哺乳动物细胞群；b)通过单细胞克隆从该哺乳动物细胞群获得单个细胞；c)将这些单个细胞进行扩增和传代，直到这些单个细胞恢复至90％或更大的活力并且倍增时间小于30小时。
12、在某些实施例中，该细胞培养基不含igf-1。
13、在某些实施例中，这些哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在某些实施例中，这些cho细胞缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr-)或是谷氨酰胺合成酶敲除(gsko)型。
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1.一种从哺乳动物细胞培养来生产目的蛋白的方法，该方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中该第二细胞培养基含有少于0.03mg/L的IGF-1。
3.如权利要求2所述的方法，其中该第二细胞培养基不含IGF-1。
4.如权利要求1所述的方法，其中该第一细胞培养基不含IGF-1。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该哺乳动物细胞具有与尚未直接适应缺乏IGF-1的培养基的相同谱系的哺乳动物细胞相当的生长速率。
6.如权利要求5所述的方法，其中该哺乳动物细胞的倍增时间少于30小时。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在该培养的第10天，所表达的目的蛋白的滴度为至少50mg/L。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该目的蛋白是抗原结合蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其中该目的蛋白选自由单克隆抗体、双特异性T细胞接合子、免疫球蛋白、Fc融合蛋白和肽体组成的组。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞培养工艺利用补料分批培养工艺、
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过在含有0.03mg/L或更少的IGF-1的无血清培养基中，为至少100L的生物反应器接种至少0.5×106至3.0×106个细胞/mL来建立该哺乳动物细胞培养。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中这些哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中这些CHO细胞缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR-)或是谷氨酰胺合成酶敲除(GSKO)型。
14.如权利要求1所述的方法，其中将回收的目的蛋白纯化并配制成药学上可接受的配制品。
15.如权利要求14所述的纯化的、配制的目的蛋白。
16.一种用于使哺乳动物细胞直接适应IGF-培养基的方法，该方法包括：
17.如权利要求16所述的方法，其中该细胞培养基不包含IGF-1。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中这些哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中这些CHO细胞缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR-)或是谷氨酰胺合成酶敲除(GSKO)型。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从哺乳动物细胞培养来生产目的蛋白的方法，该方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中该第二细胞培养基含有少于0.03mg/l的igf-1。
3.如权利要求2所述的方法，其中该第二细胞培养基不含igf-1。
4.如权利要求1所述的方法，其中该第一细胞培养基不含igf-1。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该哺乳动物细胞具有与尚未直接适应缺乏igf-1的培养基的相同谱系的哺乳动物细胞相当的生长速率。
6.如权利要求5所述的方法，其中该哺乳动物细胞的倍增时间少于30小时。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在该培养的第10天，所表达的目的蛋白的滴度为至少50mg/l。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该目的蛋白是抗原结合蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其中该目的蛋白选自由单克隆抗体、双特异性t细胞接合子、免疫球蛋白、fc融合蛋白和肽体组成的组。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞培养工艺利用补料分批培养工艺、灌注培养工艺、或其组合。
【专利技术属性】
技术研发人员：K·M·达里斯，H·T·N·乐，E·吉斯莱森，T·P·蒙罗，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：
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