【技术实现步骤摘要】
本专利技术实施例涉及生物制剂，具体涉及一种靶向m细胞的结核病黏膜疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染所致的结核病(tuberculosis，tb)是危害全球人类健康的第一传染病。随着艾滋病与tb的合并感染，耐药性tb的增多，tb的形势更为严峻，成为当前全球重大公共卫生问题。卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)是目前用于预防tb的唯一疫苗，但其只对儿童结核性脑膜炎和全身粟粒性结核具有较好的保护效果，而对成人tb保护效果欠佳，因此迫切需要研制新型tb疫苗。
2、mtb主要经呼吸道侵入机体，呼吸道黏膜免疫是机体抵抗mtb的第一道防线。由于传统tb疫苗主要经皮下和肌肉注射，诱生的主要是全身系统性免疫，而对黏膜免疫系统的作用较小。因此开发经黏膜途径免疫的黏膜疫苗是当前tb疫苗研究的重要方向。
3、人体的黏膜组织具有黏膜屏障结构，较为复杂，且黏膜免疫系统的结构和功能又不同于传统的全身系统性免疫系统。黏膜疫苗的研发主要有三个重要环节：一是高效的黏膜免疫递送载体，二是合适的黏膜免疫佐剂，三是合适的靶抗原。如何能将抗原高效地递送到黏膜免疫系统而诱发理想的特异性黏膜免疫应答是限制当前黏膜疫苗发展的瓶颈技术。
技术实现思路
1、本申请是基于专利技术人的如下认识所作出的：
2、微褶细胞(microfold cells，m cells)是一类特殊的黏膜上皮细胞，是启动
3、mtb抗原分为两类：增殖期抗原和休眠期抗原。在增殖期抗原中，ag85a、ag85b和esat-6是目前疫苗选用最多的靶抗原，这三个蛋白均具有多个t细胞和b细胞表位，有良好的免疫原性。其中esat-6还是bcg与mtb的差异蛋白，与mtb的毒力密切相关。本课题组前期构建了ag85b和esat-6的融合蛋白ag85b-esat-6，研究表明ag85b-esat-6融合蛋白免疫小鼠和豚鼠后，具有较单个蛋白更好的免疫原性，能强烈诱生机体产生针对单个抗原的特异性体液和细胞免疫，并对mtb感染具有更好的保护效果。
4、mtb休眠期抗原是mtb在休眠期表达的一组抗原，共48个。其中rv2031c，即hspx，是mtb休眠菌表达量较高的一个休眠相关抗原，而rv2626c是在mtb潜伏感染者中识别率较高的一个抗原。研究表明，诱导rv2031c抗原特异性的免疫反应有利于机体抵抗mtb休眠菌。zhubd等研究发现，含rv2626c的tb疫苗对mtb感染小鼠具有长期的免疫保护效果，有利于清除mtb休眠菌。我们构建了rv2031c和rv2626c的融合蛋白，即rv2031c-rv2626c。研究表明，该融合蛋白能较好地保持单个抗原的免疫原性，并能在小鼠体内诱导针对单个抗原的特异性体液和细胞免疫，是潜在的疫苗靶抗原。
5、为此，本专利技术实施例提供一种靶向m细胞的结核病黏膜疫苗及其制备方法。
6、为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
7、根据本专利技术实施例的第一方面，本专利技术提供一种靶向m细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，所述方法包括：
8、n端乙酰化的m细胞靶向肽ac-cksthplsc在溶剂、edc、nhs、偶联缓冲液存在的条件下进行活化，然后加入β-巯基乙醇，再加入脱乙酰壳聚糖溶液进行偶联反应，经透析，得到偶联m细胞靶向肽的壳聚糖溶液；
9、偶联m细胞靶向肽的壳聚糖溶液与抗原溶液混合，逐滴滴入三聚磷酸纳溶液，搅拌，离心，收集壳聚糖微球；
10、用无菌pbs重悬壳聚糖微球，得到所述结核病黏膜疫苗。
11、进一步地，ac-cksthplsc、edc与nhs的质量比为0.2:0.25:0.15；
12、所述溶剂为dmso、去离子水；
13、所述偶联缓冲液为ph＝6.0的mes缓冲液；
14、所述活化的条件为：于室温搅拌2h。
15、进一步地，所述β-巯基乙醇的终浓度为20mm；
16、所述脱乙酰壳聚糖溶液的浓度为0.1％，ph＝5.7，其配制方法如下：将10mg、分子量50,000-190,000da的脱乙酰壳聚糖溶解在10ml 2％hac中，37℃磁力搅拌，用naoh调节ph至5.7，形成浓度为0.1％的脱乙酰壳聚糖溶液。
17、进一步地，所述脱乙酰壳聚糖与ac-cksthplsc的摩尔比为1:1-4；
18、所述偶联反应的条件为：于室温搅拌24h。
19、进一步地，所述透析的条件为：于4℃下用纯水透析3-4d，mwco＝12,000da。
20、进一步地，所述抗原溶液由体积比为1:1的200μg/mlag85b-esat-6溶液和200μg/ml rv2031c-rv2626c溶液组成；
21、所述三聚磷酸纳的浓度为1.5％；
22、所述抗原溶液、偶联m细胞靶向肽的壳聚糖溶液与三聚磷酸纳溶液的体积比为0.4:10:0.12。
23、进一步地，所述搅拌的条件为：在室温搅拌24h；
24、所述离心的条件为：12,000rpm离心20min。
25、根据本专利技术实施例的第二方面，本专利技术提供一种靶向m细胞的结核病黏膜疫苗，其由如上任一项所述的方法制成。
26、本专利技术实施例具有如下优点：
27、本专利技术利用m细胞靶向肽ac-cksthplsc与壳聚糖偶联，制备具有m细胞靶向的壳聚糖纳米微球，并用其包裹mtb抗原融合蛋白ag85b-esat-6、rv2031c-rv2626c，构建成具有m细胞靶向的结核病新型黏膜疫苗mtb-m-cs-nps。将该纳米颗粒悬浮于pbs中，滴鼻免疫小鼠。结果表明，该纳米颗粒经黏膜免疫后可有效递送抗原，能刺激小鼠的黏膜系统产生抗原特异性免疫，并激发小鼠产生全身系统性的抗原特异性的体液免疫和细胞免疫，对经呼吸道感染的分枝杆菌具有一定的保护效果。
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1.一种靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的靶向M细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
8.一种靶向M细胞的结核病黏膜疫苗，其特征在于，其由权利要求1-7中任一项所述的方法制成。
【技术特征摘要】
1.一种靶向m细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的靶向m细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的靶向m细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的靶向m细胞的结核病黏膜疫苗的制备方法，其特征在于，
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【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，姜泓，康健，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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