【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是一种细胞释放到细胞外基质的小囊泡，通过分泌途径的不同可以分为外泌体和微囊泡两大类。evs中包含细胞来源的dna、rna片段、蛋白质和脂质等物质，可以通过近距离或远距离将这些物质转移到其他细胞。一旦到达受体细胞，evs中的物质可以改变靶细胞的功能。因此，evs被认为具有广阔的应用前景，可以作为药物载体和靶标等。
2、根据来源的不同，evs可以分为细胞上清来源evs、体液来源evs和组织来源evs。细胞上清来源evs方便获取，结果可重复，但丧失了与其他细胞的通讯。体液来源evs主要是血细胞释放的，但也存在其他来源，因此具有混合性和复杂性。而组织来源evs保留了肿瘤微环境的关键信息，具有组织特异性和敏感性，更接近真实的微环境，具有更丰富的信息来源和更纯净的排他性，因此具有重要的研究价值。
3、目前，从血液、尿液和唾液等体液中分离evs已经相对成熟，例如cn202110806558.9公开了一种循环细胞外囊泡原位标记和快速分离方法，将磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质注射到受试者的血液循环系统，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质在游离状态下自行组装至循环细胞外囊泡的细胞膜磷脂双分子层上。该标记方法可应用在循环细胞外囊泡代谢动力学监测和从活体中快速分离出循环细胞外囊泡等方面。但直接从组织中分离evs的研究还很有限。
4、目前常用的组织evs分离方法主要包括物理切碎、酶消化
5、然而，这些方法存在一些问题。首先，物理切碎步骤耗时长且流程复杂，需要较长的时间和复杂的实验操作。其次，酶消化后，evs与组织微环境的联系断裂，导致evs的来源信息丧失，包括细胞来源和空间分布等重要信息。此外，超速离心存在回收率低、纯度低和实验过程耗时等问题，影响evs的提取效率和纯度。
6、因此，如何实现对组织evs的精确分离和空间定位仍然具有挑战。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的，在于提供一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法。
2、本专利技术解决其技术问题的所采用的技术方案是：
3、一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，包括如下步骤：
4、步骤一，在载体上修饰抗体，所述抗体能够和组织中的囊泡结合；
5、步骤二，组织进行切片，并在步骤一修饰了抗体的载体上进行孵育，使囊泡被载体上修饰的抗体捕获；
6、步骤三，添加核酸适配体，所述的核酸适配体具有一识别区以及一延长链，所述识别区能够识别被捕获囊泡的膜蛋白；
7、步骤四，利用核酸适配体延长链作为模板，进行rca反应；
8、步骤五，加入荧光探针，使其与步骤四的rca产物结合，从而产生荧光信号，从而实现对组织细胞外囊泡的成像。
9、进一步地，步骤一中，所述载体包括共聚焦皿、载玻片、膜片中的至少一种。
10、进一步地，步骤一中，先将链霉亲和素sa修饰在载体上，然后加入抗体，所述抗体具有生物素，通过sa与生物素之间的结合力，在sa功能化的界面上修饰抗体。
11、进一步地，步骤一中，加入5％牛血清白蛋白溶液和10μg/ml鲑鱼精dna对未修饰抗体的位点进行封闭。
12、进一步地，步骤二中，切片厚度范围为100μm-200μm。
13、进一步地，所述的核酸适配体具有多种，每种分别对应组织细胞外囊泡的一靶标。
14、进一步地，步骤四中，加入与核酸适配体延长链互补的锁式探针、t4连接酶、dntp和φ29酶进行滚环扩增反应。
15、进一步地，rca反应条件为37℃反应1小时，温度为φ29酶的最适温度。
16、进一步地，步骤五中，成像采用共聚焦显微镜。
17、本技术方案与
技术介绍
相比，具有如下优点：
18、本专利技术解决了组织evs分离和检测的困难性，开发了一种高效的原位捕获组织evs的界面，并结合滚环扩增技术进行信号放大，以实现对组织evs的高特异性和高灵敏度检测。
19、通过开发新的界面技术，可以在组织中实现对evs的直接捕获，避免了物理切碎和酶消化等步骤对evs来源信息的丢失。通过滚环扩增技术的应用，可以对捕获到的evs进行信号放大，提高检测的特异性和灵敏度。
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1.一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于：步骤一中，所述载体包括共聚焦皿、载玻片、膜片中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于，步骤一中，先将链霉亲和素SA修饰在载体上，然后加入抗体，所述抗体修饰有生物素，通过SA与生物素之间的结合力，在SA功能化的界面上修饰抗体。
4.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于，步骤一中，加入5％牛血清白蛋白溶液和10μg/mL鲑鱼精DNA对未修饰抗体的位点进行封闭。
5.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于，步骤二中，切片厚度范围为100μm-200μm。
6.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于：所述的核酸适配体具有多种，每种分别对应组织细胞外囊泡的一种靶标。
7.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于
8.根据权利要求5所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于：RCA反应条件为37℃反应1小时，温度为Φ29酶的最适温度。
9.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于：步骤五中，成像采用共聚焦显微镜。
...【技术特征摘要】
1.一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于：步骤一中，所述载体包括共聚焦皿、载玻片、膜片中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于，步骤一中，先将链霉亲和素sa修饰在载体上，然后加入抗体，所述抗体修饰有生物素，通过sa与生物素之间的结合力，在sa功能化的界面上修饰抗体。
4.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕获和成像方法，其特征在于，步骤一中，加入5％牛血清白蛋白溶液和10μg/ml鲑鱼精dna对未修饰抗体的位点进行封闭。
5.根据权利要求1所述的一种组织细胞外囊泡的原位捕...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，张倩楠，许醒，文千禧，吴秋月，张桂华，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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