【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肽及其制备方法和应用，具体涉及一种薄壳源肽ltwr及其制备方法和应用。
技术介绍
1、二型糖尿病(type 2diabetes mellitus,t2dm)是一种慢性代谢性疾病，通常与高血糖水平和胰岛素抵抗有关。t2dm患者的胰岛素不能有效地将葡萄糖从血液中转运到细胞内，导致血糖升高。
2、dpp-iv(dipeptidyl peptidase-4)是一种酶，存在于人体的小肠黏膜、免疫细胞和其他组织中，能够降解促进胰岛素的分泌胰高血糖素(glp-1)，导致t2dm患者的体内glp-1水平下降，胰岛素分泌减弱，血糖升高。目前糖尿病治疗药物有dpp-iv抑制剂西格列汀、维格列汀等，但这些药物存在一定的副作用且价格昂贵。因此急需开发安全性高、副作用小的新型天然dpp-ⅳ抑制剂。
3、目前大量研究表明食物蛋白源生物活性肽是潜在的天然活性因子，具有多种多样的生理功能活性，包括抗氧化、降血糖、降血脂、降血压、抗疲劳等，因此通过膳食补充生物活性肽辅助降血糖具有重要意义。薄壳，也叫海瓜子，学名寻氏肌蛤(musculussenhousei)，是分布在沿海地区的一种常见贝类，蛋白质含量丰富，富含多种人体必需的氨基酸和微量营养物质，是一种营养价值高的大众化海产品。但是目前薄壳加工程度普遍不高，而且目前尚无高效快速鉴定薄壳源dpp-iv抑制肽的报道。
4、传统的生物活性肽分离纯化方法主要包括凝胶过滤、离子交换、反相高效液相色谱分离等，分离纯化过程耗时长且过程繁琐，因此急需开发一种更加便捷可行的筛选具
5、目前关于dpp-iv抑制肽的制备大多集中在使用商业蛋白酶进行酶解后再经凝胶过滤、离子交换、反相高效液相色谱等方法分离后再对活性最强的组分进行鉴定。现有技术获取新生物活性肽的方法大多是通过蛋白酶酶解后以生物活性为导向再经过分离纯化后鉴定，步骤繁琐且耗时长。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种薄壳源肽ltwr及其制备方法和应用，采用直接对新鲜薄壳酶解处理提取到的薄壳生物活性肽构建高质量薄壳生物活性肽库的新策略，再通过计算机辅助筛选和分子对接的方法快速高通量的筛选具有良好的dpp-iv抑制活性的肽，进而得到一种能够具有降血糖功能的肽。
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种薄壳源肽ltwr，所述薄壳源肽ltwr的氨基酸序列为leu-thr-trp-arg(ltwr)，分子量为574.73da。
4、如上所述薄壳源肽ltwr在降血糖方面的应用。
5、一种薄壳源肽ltwr的制备方法，包含以下操作步骤：
6、(1)薄壳源肽ltwr的提取：从薄壳中提取肽制成冻干样品，然后测定所得冻干样品的dpp-iv抑制活性；所述提取的方法为碱性蛋白酶提取、中性蛋白酶提取或木瓜蛋白酶提取方法中的至少一种；
7、(2)薄壳多肽库的构建：采用纳升级液相色谱-电喷雾-超高分辨飞行时间串联质谱对活性肽片段进行鉴定，即将步骤(1)中所得活性最强的冻干样品溶于体积浓度为0.1％的甲酸水中，经acclaim pep maptm rslc柱分离；
8、应用多肽组学策略对acclaim pep maptm rslc柱分离后所得冻干样品中的肽段进行肽序列鉴定，将鉴定后的所有多肽纳入多肽库，并建立薄壳多肽库；
9、(3)计算机辅助筛选：利用peptide ranker软件对步骤(2)中薄壳多肽库中的肽段进行潜在生物活性预测，利用toxin pred软件预测和计算步骤(2)中薄壳多肽库中肽段的潜在毒性和理化性质，利用allertop软件预测和计算步骤(2)中薄壳多肽库中的肽段的潜在致敏性，使用biopep数据库预测筛选出的无潜在毒性且无潜在致敏性的肽段的生物活性，筛选到10条具有潜在dpp-iv抑制活性、无毒性且无潜在致敏性的肽段，所述10条肽段的序列分别为：ltwr、kgfp、pvf、agggr、hgg、kwk、gggh、gggq、sggr、csl；
10、(4)分子对接筛选：利用autodock vina对步骤(3)中得到的10条肽段进行分子对接，从蛋白质结构数据库(proteindata bank，pdb)中获取dpp-iv的结构文件，去除配体和h2o后与肽段对接，筛选出对接后结合能最低的肽段ltwr和kgfp；
11、(5)体外合成验证：以步骤(4)中对接后的结合能为基准，该评分反映了肽与蛋白质结合后的稳定性，结合能越低表明多肽和蛋白质之间的结合越牢固和紧密，基于此，从步骤(4)中筛选出对接后结合能最低的2条肽段ltwr和kgfp分别进行固相合成，得到不同的合成肽(纯度>95％的多肽固体粉末)，将合成肽配制成合成肽溶液后对合成肽进行体外dpp-iv抑制活性验证，最终得出体外活性验证结果较佳的肽段ltwr，即为本专利技术目标肽。
12、进一步地，步骤(1)中所述的碱性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水中，用1m hcl调节ph至8，为碱性蛋白酶最适ph，添加2％-5％(w/w，按原料薄壳肉中的蛋白含量计算)碱性蛋白酶，在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
13、进一步地，步骤(1)中所述的中性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1m hcl和1m naoh调节ph至7.0，为中性蛋白酶最适ph；用0.2％-5％(w/w，按原料薄壳肉中的蛋白含量计算)中性蛋白酶在50℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
14、进一步地，步骤(1)中所述的木瓜蛋白酶提取为取一定质量搅碎的新鲜薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1m hcl和1m naoh调节ph至7.0；用0.2％-5％(w/w，按原料薄壳肉中的蛋白含量计算)中性蛋白酶在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
15、进一步地，步骤(1)中所述的测定dpp-iv抑制活性：向96孔酶标板中加入50μl不同浓度样品溶液与25μl底物gly-pro-pna(0.8mm)，混合后37℃孵育10min，加入50μl dpp-iv酶液(0.8u/μl)，混匀后37℃孵育90min，使用多功能酶标仪记录405nm下的吸光度值，每2min记录一下，持续90min；以纯水作为空白对照，随机选取吸光值线性变化的两个时间点t1、t2，计本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种薄壳源肽LTWR，其特征在于；所述薄壳源肽LTWR的氨基酸序列为Leu-Thr-Trp-Arg(LTWR)，分子量为574.73Da。
2.如权利要求1所述薄壳源肽LTWR在降血糖方面的应用。
3.一种如权利要求1-2任一所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
4.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的碱性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水中，用1M HCl调节pH至8，添加2％-5％碱性蛋白酶，在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
5.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的中性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1M HCl和1M NaOH调节pH至7.0；用0.2％-5％中性蛋白酶在50℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，
6.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的木瓜蛋白酶提取为取一定质量搅碎的新鲜薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1M HCl和1M NaOH调节pH至7.0；用0.2％-5％木瓜蛋白酶在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
7.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的测定DPP-IV抑制活性和步骤(5)中所述的DPP-IV抑制活性的操作皆为：向酶标板中加入50μL不同浓度样品溶液与25μL底物Gly-Pro-pNA混合后37℃孵育10min，加入50μL DPP-IV酶液，混匀后37℃孵育90min，记录405nm下的吸光度值，每2min记录一下，持续90min；以纯水作为空白对照，随机选取吸光值线性变化的两个时间点T1、T2，计算其斜率Slope，采用以下公式计算样品溶液的DPP-IV抑制活力：
8.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述AcclaimPep MapTM RSLC柱分离具体参数为流动相包括：A：体积浓度为0.1％甲酸水溶液和B：0.2％FA乙腈溶液；设置流速为0.3μL/min，洗脱梯度为：0-2min，3-8％B；2-48min，8-26％B；48-53min，26-35％B；53-57min，35-100％B；57-60min，100％B。
9.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(4)中DPP-IV的结构文件从蛋白质结构数据库中获取，代码为1WCY，对接前去除配体和H2O，对接位点中心设置为55.1、63.6、34.8，方格大小为
10.根据权利要求3所述薄壳源肽LTWR的制备方法，其特征在于：步骤(5)中将合成肽用去离子水配制成0.4-2.5mM浓度的合成肽溶液后进行体外DPP-IV抑制活性测定。
...【技术特征摘要】
1.一种薄壳源肽ltwr，其特征在于；所述薄壳源肽ltwr的氨基酸序列为leu-thr-trp-arg(ltwr)，分子量为574.73da。
2.如权利要求1所述薄壳源肽ltwr在降血糖方面的应用。
3.一种如权利要求1-2任一所述薄壳源肽ltwr的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
4.根据权利要求3所述薄壳源肽ltwr的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的碱性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水中，用1m hcl调节ph至8，添加2％-5％碱性蛋白酶，在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
5.根据权利要求3所述薄壳源肽ltwr的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的中性蛋白酶提取为取一定质量新鲜的薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1m hcl和1m naoh调节ph至7.0；用0.2％-5％中性蛋白酶在50℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收集上清液并冷冻干燥。
6.根据权利要求3所述薄壳源肽ltwr的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的木瓜蛋白酶提取为取一定质量搅碎的新鲜薄壳肉，加入3-5倍体积纯水，用1m hcl和1m naoh调节ph至7.0；用0.2％-5％木瓜蛋白酶在55℃条件下水解2-10h，水解结束后，将水解后所得物质置于沸水浴10min灭酶，冷却至室温，将灭酶后所得混合物离心收...
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