【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种t4 dna连接酶的活性定量检测方法及其应用。
技术介绍
1、t4 dna连接酶可以催化粘端或平端双链dna或rna的5’-p末端和3’-0h末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需atp作为辅助因子。同时t4 dna连接酶可以修补双链dna、双链rna或dna/rna杂合物上的单链缺口。
2、t4 dna连接酶常见主要应用于分子克隆中载体与片段的连接。随着基因测序技术的发展，t4 dna连接酶广泛使用于生物医学检测实验。目前基因测序的步骤如待测序列和接头之间的连接、测序探针和测序引物之间的固定都用到t4 dna连接酶。
3、由于上述多种重要的用途，准确测定t4 dna连接酶的活性，保证批次活性的稳定性，具有至关重要的意义。现有产品的t4 dna连接酶测定方法主要依赖于放射性元素p标记的atp反应中生成带有放射性元素p标记的ppi来定量。现有技术中测定方法需主要是用于检测dna与rna杂合连接所需要的pbcv-1dna连接酶活性，连接后再加入rnaseh消除掉rna连，暴露出连接产物dna单链，通过dna单链荧光淬灭值来确定连接产物从而确定dna连接酶活性。
4、因此，亟需提供一种能够克服放射性污染，洁净、简单、准确，适用性强的t4 dna连接酶的活性定量检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种t4 dna连接酶的活性定量检测方法及其应用，解决了现有方法存在放射性污染，需要进行沉淀、
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种t4 dna连接酶的活性定量检测方法，所述方法包括：引物a和引物b混合后退火形成引物c，将引物c与t4 dna连接酶混合连接后将产物与甲酰胺混合，根据t4 dna连接酶的酶活和荧光下降值的关系曲线定量酶活，从而计算出所述t4dna连接酶的活性。
4、本专利技术方法能够克服放射性污染，洁净、简单、准确，适用性强，能够对双链dna、dna-rna杂合双链和双链rna连接反应中的t4 dna连接酶的活性进行定量。
5、优选地，所述引物a的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
6、优选地，所述荧光基团包括fam、cy5或rox中任意一种或至少两种的组合；所述淬灭基团包括tamra、bhq1或bhq2中任意一种或至少两种的组合。
7、优选地，所述引物b的5’端含有荧光基团，3’端不含有淬灭基团。
8、优选地，所述荧光基团包括fam、cy5或rox中任意一种或至少两种的组合。
9、优选地，所述引物a和引物b的摩尔比例为1:(1-3)。
10、上述1-3中的具体点值可以选择1、2或3等。
11、优选地，所述退火的反应条件为94℃-96℃，5-10min；54℃-60℃，20-40min。
12、上述94℃-96℃中的具体点值可以选择94℃、95℃或96℃等。
13、上述5-10min中的具体点值可以选择5min、6min、7min、8min、9min或10min等。
14、上述54℃-60℃中的具体点值可以选择54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃等。
15、上述20-40min中的具体点值可以选择20min、25min、30min、35min、38min或40min等。
16、优选地，所述甲酰胺的浓度为50％-100％。
17、上述50％-100％中的具体点值可以选择50％、60％、70％、80％、90％或100％等。
18、优选地，所述产物与甲酰胺混合的温度为20℃-28℃，时间为0.5-2min。
19、上述20℃-28℃℃中的具体点值可以选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃等。
20、上述0.5-2min中的具体点值可以选择0.5min、0.8min、1.0min、1.2min、1.6min或2min等。
21、第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的方法在检测连接反应中t4 dna连接酶活性中的应用。
22、优选地，所述连接反应包括dna双链连接反应、dna-rna杂合双链连接反应或rna双链连接反应中的任意一种。
23、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
24、(1)本专利技术方法能够克服放射性污染，洁净、简单、准确，适用性强，能够对双链dna、dna-rna杂合双链和双链rna连接反应中的t4 dna连接酶的活性进行定量；
25、(2)本专利技术不需要进行沉淀、过滤等多个步骤，周期短，能够实现高通量、自动化筛选。
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1.一种T4 DNA连接酶的活性定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物A的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、CY5或ROX中任意一种或至少两种的组合；所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述引物B的5’端含有荧光基团，3’端不含有淬灭基团；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述引物A和引物B的摩尔比例为1:(1-3)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述退火的反应条件为94℃-96℃，5-10min；54℃-60℃，20-40min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述甲酰胺的浓度为50％-100％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述产物与甲酰胺混合的温度为20℃-28℃，时间为0.5
9.权利要求1-8中任一项所述的方法在检测连接反应中T4 DNA连接酶活性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述连接反应包括DNA双链连接反应、DNA-RNA杂合双链连接反应或RNA双链连接反应中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种t4 dna连接酶的活性定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物a的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光基团包括fam、cy5或rox中任意一种或至少两种的组合；所述淬灭基团包括tamra、bhq1或bhq2中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述引物b的5’端含有荧光基团，3’端不含有淬灭基团；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述引物a和引物b的摩尔比例为1:(1-3)。
6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：周娇娇，王佑富，孙宇鹏，兰山，隋相坤，
申请(专利权)人：深圳太古语科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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