【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、基于pcr的测定目前是rna检测的金标准，因为它们可实现高灵敏度(约1个拷贝/μl)，并且测定时间在2小时以内。crispr-cas13是vi型crispr系统，通过利用其rna激活的rna酶活性以在指导rna引导的靶rna结合时切割荧光报道子而提供了定量rna的替代方法(east-seletsky et al.，2016)。虽然可将cas13与逆转录、扩增和转录进行组合来提高灵敏度(gootenberg et al.，2017)，但用cas13直接检测rna避免了那些步骤的限制，并且可通过将识别靶rna不同区域的多种crrna进行组合来实现适度的灵敏度。对于sar-cov-2基因组，用lbucas13a直接检测使得当使用三种crrna时用能够在30分钟内测量低至约200个拷贝/μl(fozouni et al.，2021)，并且当使用八种crrna时能够在2小时内测量约63个拷贝/μl(liu et al.，2021)。然而，用直接cas 13检测尚未实现pcr水平灵敏度，并且用于鉴定多种病毒变体中的哪一种存在于单个样品中的方法有限(jiao et al.，2021)。
2、目前用于诊断应用的cas13和cas12核酸酶的使用也依赖于在存在靶rna或dna的情况下产生荧光信号的整体(bulk)反应，这意味着无法观察到单独cas-指导-靶复合物的动力学。通过目前可用的方法只可观察到cas-指导-靶复合物信号的整体组合。作为结果，这样的整体测定方法不适合于检测变体。
技术实现
1、如本文中所述，通过将cas核酸酶反应包封在微滴中并测量/监测cas核酸酶反应的动力学，可在短的检测时间内实现具有高灵敏度和多重特异性的rna检测。rna靶标的微滴检测使得能够基于阳性微滴的数量对每种靶rna的绝对量进行定量。不同于微滴式数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)，本文中所述方法中使用的小微滴体积加速直接cas核酸酶反应的信号累积。例如，当单个靶rna被包封在体积为约10皮升的微滴中时，cas13信号累积速率等同于包含105个拷贝/μl靶rna的整体反应的累积速率(参见，例如，图1a)。此外，通过使用不同的crispr指导rna(crispr guide rna，crrna)可同时检测到不同的靶rna(例如，不同的rna病毒)。
2、本文中描述了测定混合物，其包含直径范围为至少10至60μm的微滴群体，所述群体包含含有至少一种核糖核蛋白复合物、加上至少一种报道rna、加上至少一种靶rna的测试微滴亚群。核糖核蛋白复合物可包含cas核酸酶和crispr指导rna(crrna)。当核糖核蛋白复合物(通过crrna)结合时，核糖核蛋白复合物切割报道rna，以释放可检测信号。因此，本文中描述了可包含微滴群体的测定混合物。微滴的平均直径可在至少10至60μm的范围内。微滴群体包含含有至少一种核糖核蛋白(ribonucleoprotein，rnp)复合物、加上至少一种报道rna、加上至少一种靶rna的测试微滴亚群。在一些情况下，群体可包含不含有核糖核蛋白复合物、报道rna或靶rna中的一种或更多种的微滴；这些微滴可用作对照微滴。例如，对照微滴可用于限定荧光的背景水平。
3、在一些情况下，crrna可具有与crrna 5’端共价连接的聚合物。cas核酸酶和这样的crrna-聚合物杂合体的核糖核蛋白复合物表现出降低的核酸酶活性，这可促进对核酸酶反应的动力学进行分析。另外，在不同的crrna上使用不同的聚合物可增强信号动力学的差异，从而改善对复杂的靶rna混合物中不同靶rna的检测。在一些情况下，包括一系列不同的crrna-聚合物杂合体(和至少一种类型的cas核酸酶)的整体测定可提供来自不同靶rna相互作用的易于区分的信号。因此，当使用crrna-聚合物杂合体来检测和鉴定不同的靶rna时，使用微滴测定是不允许被需要的。
4、用于crrna-聚合物杂合体的聚合物可以是，例如，聚乙二醇、聚[氧基(11-(3-(9-腺嘌呤基)丙酸基(propionato))-十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](pech-ap)、聚[氧基(11-(5-(9-腺嘌呤乙氧基)-4-氧代戊酸基(oxopentanoato))十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](pech-as)、dna或其组合。在一些情况下，聚合物是dna(单链或双链dna)。据认为，用于crrna-聚合物杂合体的聚合物可降低具有crrna-聚合物杂合体的核糖核蛋白复合物中cas核酸酶的高等真核生物和原核生物核苷酸结合(higher-eukaryotes-and-prokaryotesnucleotide-binding，hepn)结构域的折叠、形成或活性。例如，聚合物可至少部分地封闭hepn结构域。聚合物可具有可变长度，但一般来说，与较短的聚合物相比，较长的聚合物更大程度降低核糖核蛋白复合物的核酸酶活性。
5、本文中还描述了用于检测和/或鉴定至少一种靶rna的方法。这样的方法可涉及测量和/或监测微滴群体中的单独微滴的荧光，其中所述群体包含至少一种含有靶rna、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna的微滴。这样的微滴群体包含至少两个、至少三个、至少五个、至少七个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少三十个、至少五十个微滴，每个微滴包含靶rna、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna。
6、本文中还描述了用于检测和/或鉴定至少一种靶rna的方法，其涉及使用crrna-聚合物杂合体。这样的方法可涉及测量和/或监测测定混合物的荧光，所述测定混合物可包含至少一种靶rna、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna，其中所述核糖核蛋白复合物包含cas核酸酶和crrna-聚合物杂合体。
7、在整个微滴群体中，靶rna可以是相同的靶rna。然而，在许多情况下，不同的微滴可各自包含不同的靶rna或不同的靶rna组合。靶rna可以是一种或更多种病毒rna、原核rna、真核rna或其组合。
8、在一些情况下，至少一种靶rna可以是野生型靶rna序列。在一些情况下，至少一种靶rna可以是变体或突变体靶rna序列。靶rna的实例包括来自以下中的rna：一种或更多种sars冠状病毒(sars-cov-1和/或sars-cov-2)、正黏病毒(流感病毒)、丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)、埃博拉(ebola)、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、人嗜t淋巴细胞病毒1型(human t-cell lymphotropic virus type 1，htlv-1)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)或其组合。在一些情况下，至少一种靶rna是冠状病毒rna。在一些情况下，至少一种靶rna可以是用于疾病标志物的rna。在一些情况下，至少一种靶rna可以是微rna(microrna)。
9、本文中还描述了可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.包括测量或监测微滴群体中单独微滴的荧光的方法，所述群体包含至少一个包含靶RNA、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道RNA的微滴。
2.权利要求1所述的方法，其中所述群体包含至少两个、至少三个、至少五个、至少七个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少三十个、至少五十个微滴，每个微滴包含靶RNA、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道RNA。
3.权利要求1所述的方法，其中所述微滴群体中的靶RNA是相同的靶RNA。
4.权利要求1所述的方法，其中不同的微滴可含有或包含不同的靶RNA。
5.权利要求1所述的方法，其中每种靶RNA包含病毒RNA、原核RNA或真核RNA。
6.权利要求1所述的方法，其中至少一种靶RNA包含野生型靶RNA序列。
7.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶RNA包含变体或突变体靶RNA序列。
8.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶RNA包含一种或更多种SARS冠状病毒(SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2)、正黏病毒(流感病毒)、丙型肝炎病毒(HCV)、
9.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶RNA包含冠状病毒RNA。
10.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶RNA包含疾病标志物的RNA。
11.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶RNA包含微RNA。
12.权利要求1所述的方法，其中一个或更多个单独微滴中的核糖核蛋白复合物包含至少一种Cas核酸酶和至少一种CRISPR指导RNA(crRNA)。
13.权利要求1所述的方法，其中一个或更多个单独微滴中的核糖核蛋白复合物包含CRISPR指导RNA(crRNA)，所述CRISPR指导RNA(crRNA)包含RNA-聚合物杂合体或基本上由RNA-聚合物杂合体组成，其中聚合物与至少一种crRNA的5’端共价连接。
14.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物抑制对至少一种所述报道RNA的切割。
15.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物降低Cas核酸酶高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域的折叠、形成或活性。
16.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物包含聚乙二醇、聚[氧基(11-(3-(9-腺嘌呤基)丙酸基)-十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](PECH-AP)、聚[氧基(11-(5-(9-腺嘌呤乙氧基)-4-氧代戊酸基)十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](PECH-AS)、包含天然或非天然键联和/或天然或非天然核苷酸的单链DNA，或其组合。
17.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物包含与所述crRNA的5’端共价连接的接头和降低所述Cas核酸酶活性的区段。
18.权利要求17所述的方法，其中所述接头包含6至10个核苷酸的单链DNA。
19.权利要求1所述的方法，其中所述核糖核蛋白复合物与所述靶RNA中的至少一种结合。
20.权利要求12所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas13核酸酶、Cas12核酸酶、或Cas13核酸酶和Cas12核酸酶的组合。
21.权利要求12所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas13a核酸酶、Cas13b核酸酶、Cas13c核酸酶、Cas13d核酸酶或其组合。
22.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种报道RNA包含至少一种荧光团和至少一种荧光猝灭剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述至少一种荧光团是Alexa 430、STAR 520、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 610或其组合。
24.权利要求1所述的方法，其中所述微滴的直径范围为10μm至60μm。
25.权利要求1所述的方法，其中不同的微滴包含不同的CRISPR指导RNA(crRNA)，每种crRNA包含RNA或RNA-聚合物杂合体。
26.权利要求1所述的方法，其中至少一个微滴中的核糖核蛋白复合物包含CRISPR指导RNA(crRNA)，其序列包含SEQ ID NO：1至69或70中的任一者。
27.权利要求1所述的方法，其包括随时间测量或监测荧光。
28.权利要求1所述的方法，其还包括通过对发出信号的一个或更多个所述单独微滴进行线性回归来确定以下动力学参数中的一个或更多个：信...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.包括测量或监测微滴群体中单独微滴的荧光的方法，所述群体包含至少一个包含靶rna、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna的微滴。
2.权利要求1所述的方法，其中所述群体包含至少两个、至少三个、至少五个、至少七个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少三十个、至少五十个微滴，每个微滴包含靶rna、核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna。
3.权利要求1所述的方法，其中所述微滴群体中的靶rna是相同的靶rna。
4.权利要求1所述的方法，其中不同的微滴可含有或包含不同的靶rna。
5.权利要求1所述的方法，其中每种靶rna包含病毒rna、原核rna或真核rna。
6.权利要求1所述的方法，其中至少一种靶rna包含野生型靶rna序列。
7.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶rna包含变体或突变体靶rna序列。
8.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶rna包含一种或更多种sars冠状病毒(sars-cov-1和/或sars-cov-2)、正黏病毒(流感病毒)、丙型肝炎病毒(hcv)、埃博拉、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、人嗜t淋巴细胞病毒1型(htlv-1)、人免疫缺陷病毒(hiv)或其组合。
9.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶rna包含冠状病毒rna。
10.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶rna包含疾病标志物的rna。
11.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种靶rna包含微rna。
12.权利要求1所述的方法，其中一个或更多个单独微滴中的核糖核蛋白复合物包含至少一种cas核酸酶和至少一种crispr指导rna(crrna)。
13.权利要求1所述的方法，其中一个或更多个单独微滴中的核糖核蛋白复合物包含crispr指导rna(crrna)，所述crispr指导rna(crrna)包含rna-聚合物杂合体或基本上由rna-聚合物杂合体组成，其中聚合物与至少一种crrna的5’端共价连接。
14.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物抑制对至少一种所述报道rna的切割。
15.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物降低cas核酸酶高等真核生物和原核生物核苷酸结合(hepn)结构域的折叠、形成或活性。
16.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物包含聚乙二醇、聚[氧基(11-(3-(9-腺嘌呤基)丙酸基)-十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](pech-ap)、聚[氧基(11-(5-(9-腺嘌呤乙氧基)-4-氧代戊酸基)十一烷基-1-硫代甲基)乙烯](pech-as)、包含天然或非天然键联和/或天然或非天然核苷酸的单链dna，或其组合。
17.权利要求13所述的方法，其中所述聚合物包含与所述crrna的5’端共价连接的接头和降低所述cas核酸酶活性的区段。
18.权利要求17所述的方法，其中所述接头包含6至10个核苷酸的单链dna。
19.权利要求1所述的方法，其中所述核糖核蛋白复合物与所述靶rna中的至少一种结合。
20.权利要求12所述的方法，其中所述cas核酸酶是cas13核酸酶、cas12核酸酶、或cas13核酸酶和cas12核酸酶的组合。
21.权利要求12所述的方法，其中所述cas核酸酶是cas13a核酸酶、cas13b核酸酶、cas13c核酸酶、cas13d核酸酶或其组合。
22.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种报道rna包含至少一种荧光团和至少一种荧光猝灭剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述至少一种荧光团是alexa 430、star 520、brilliant violet 510、brilliant violet 605、brilliant violet 610或其组合。
24.权利要求1所述的方法，其中所述微滴的直径范围为10μm至60μm。
25.权利要求1所述的方法，其中不同的微滴包含不同的crispr指导rna(crrna)，每种crrna包含rna或rna-聚合物杂合体。
26.权利要求1所述的方法，其中至少一个微滴中的核糖核蛋白复合物包含crispr指导rna(crrna)，其序列包含seq id no：1至69或70中的任一者。
27.权利要求1所述的方法，其包括随时间测量或监测荧光。
28.权利要求1所述的方法，其还包括通过对发出信号的一个或更多个所述单独微滴进行线性回归来确定以下动力学参数中的一个或更多个：信号随时间的斜率(斜率)、从添加靶rna或样品到酶活性开始的时间(tinit)、信号随时间的均方根差(rmsd)。
29.权利要求28所述的方法，其还包括确定一个或更多个所述单独微滴的快斜率参数，其中所述快斜率参数包含信号斜率陡峭的时间的百分比。
30.权利要求28所述的方法，其还包括确定一个或更多个所述单独微滴的慢斜率参数，其中所述慢斜率参数包含信号随时间的斜率平缓的时间的百分比。
31.权利要求1所述的方法，其还包括在测量单独微滴的荧光之前：(a)使样品与至少一种类型的核糖核蛋白复合物和至少一种类型的报道rna接触以形成反应混合物；(b)将所述反应混合物与油和...
【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·弗莱彻，孙成珉，梅拉妮·奥特，
申请(专利权)人：J·大卫格莱斯顿研究所根据J·大卫格莱斯顿遗嘱的遗嘱信托，
类型：发明
国别省市：
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