本发明专利技术公开了一种基于羟基自由基的检测对固定化酶的催化活性评价方法。以稀土金属铽离子为金属中心，均苯三甲酸为配体，形成金属有机框架材料(MOFs)载体，实现过氧化氢酶的固定化，得到铽基MOF材料固定过氧化氢酶。过氧化氢酶能够催化分解过氧化氢，从而实现对羟基自由基的消除。电子顺磁共振波谱是研究自由基的一种有效方法，利用电子顺磁共振波谱仪对羟基自由基的检测，对不同浓度的过氧化氢及对应谱图二次积分面积做标准曲线计算溶液中羟基自由基的含量，建立过氧化氢浓度与羟基自由基的含量线性关系，实现EPR对过氧化氢酶的催化活性评价。在0.2～1.0mM的浓度范围内，实现对过氧化氢的浓度检测，其相关系数为0.96，实现了利用过氧化氢对固定化酶的催化活性评价，CAT催化酶活性为15.225U·mg<supgt;‑1</supgt;，固定化酶的催化活性为15.936U·mg<supgt;‑1</supgt;。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学分析检测技术与生物酶催化领域，具体地说，涉及一种羟基自由基的检测方法及其对过氧化氢酶及固定化的催化性能评价方法。
技术介绍
1、过氧化氢酶是一种普遍存在的生物大分子催化剂，在生命进程中起着重要作用。固定化酶技术可以在保持酶的催化活性的同时提升酶面对各种环境的耐受性，金属有机框架材料(mofs)是由金属离子与有机配体通过配位作用形成的多孔骨架材料，并被广泛应用于酶的固定化。固定化酶技术主要有吸附法、包埋法及原位封装法三种，其中原位封装法是将酶和用于mofs合成的配体一起加入体系，在酶表面原位生长mofs结构，与其他方法相比，该方法有效防止酶的浸出，利于提高酶的稳定性及重复利用性。
2、过氧化氢酶催化活性的主要检测方法有紫外可见分光光度法，荧光分析法等。电子顺磁共振波谱(epr)是研究自由基的一种有效方法，近年来，有研究人员将epr应用于弹性蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸酶等的活性检测。过氧化氢酶能催化分解过氧化氢，抑制羟基自由基的产生。通过epr研究过氧化氢产生的羟基自由基，对不同浓度的过氧化化氢及对应谱图二次积分面积做标准曲线计算溶液中羟基自由基的含量，建立过氧化氢浓度与羟基自由基的含量线性关系，实现epr对过氧化氢酶的催化活性评价。
3、有鉴于此，有必要发展一种利用电子顺磁共振波谱法(epr)对过氧化氢酶的催化活性评价方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种羟基自由基的检测方法及其对过氧化氢酶及固定化的催化性能评价方法。
>2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：3、本专利技术提供了一种过氧化氢酶的固定化方法以及利用自由基检测对固定化酶催化活性的评价方法，包括以下步骤：
4、第一步，称取tb(no3)3·6h2o溶于超纯水中，超声震荡至溶解，称取均苯三甲酸加入无水乙醇中，超声震荡至溶解。
5、第二步，称取过氧化氢酶溶于超纯水中，超声震荡至溶解，再将所得溶液加入上述均苯三甲酸的乙醇溶液，混合后加入tb(no3)3水溶液，将溶液置于磁力搅拌器中搅拌。将所得淡黄色悬浊液离心，得到淡黄色固体用超纯水洗涤，得到所需固定化过氧化氢酶cat@tb-btc。
6、第三步，使用bca蛋白定量试剂盒通过酶标仪测定上清液中的酶浓度。使用牛血清蛋白为标准品测定标准曲线，计算样品的酶负载量。
7、第四步，取一定量30wt％的过氧化氢溶液分别倒入五个离心管中，用移液枪分别移取一定量的超纯水将过氧化氢溶液稀释备用。
8、第五步，取所制备的不同浓度的过氧化氢分别加入二甲基氧化茜(dmpo)进行epr测试，使用eprprocessing软件对epr谱进行二次积分处理，记录不同浓度样品的二次积分面积。以过氧化氢浓度为横坐标，以各浓度对应的epr谱图二次积分面积为纵坐标作线性回归曲线。相关系数的平方为0.96。
9、第六步，称取一定量的过氧化氢酶溶于水中，配制成一定浓度的过氧化氢酶水溶液，再称取含有与上述过氧化氢酶同等酶量的cat@tb-btc溶于水中，配制成溶液备用。取相同体积的过氧化氢酶和固定化过氧化氢酶溶液分别加入1mm h2o2溶液中，加入磷酸盐缓冲液配制成1ml溶液，在常温下孵育后取反应后的溶液加入dmpo进行epr测试，每个样品平行测试三次，分别记录谱图的二次积分面积。根据标准曲线比对出反应后过氧化氢浓度，进行酶活计算。所得固定化酶活性为15.936u·mg-1，过氧化氢酶活性为15.225u·mg-1。
10、所述第一步所需硝酸铽为227mg，均苯三甲酸为105mg，超纯水为5ml，乙醇为5ml，反应条件为常温常压，反应时间为3～4h。
11、所述第二步所需过氧化氢酶为75mg，超纯水10ml，反应条件为常温常压，反应时间为3～4h。
12、所述第四步中溶液浓度分别稀释为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm。
13、所述第五步所需过氧化氢体积为1ml，所需dmpo体积为2μl。
14、所述第六步所配置的过氧化氢酶水溶液浓度为0.5mg ml-1，所需磷酸盐缓冲液的ph为5.5，孵育时间为45min。
15、由于采用上述技术方案，本专利技术具有以下优点和有益效果：
16、本专利技术的固定化酶材料以过氧化氢酶、硝酸铽和均苯三甲酸为原料通过原位封装法制备得到。通过电子顺磁共振波谱法基于羟基自由基的检测进行固定化酶的活性测定，测定的主要依据是试样中自旋数与微波吸收曲线下所包的面积成正比，测试方法具有较高的精确度。
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【技术保护点】
1.一种基于羟基自由基的检测对固定化酶的催化活性评价方法，其特征在于：利用电子顺磁共振波谱法检测溶液中的羟基自由基，从而得到溶液中过氧化氢的浓度，实现对酶活性的测定。
2.根据权利要求1所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：底物过氧化氢浓度范围为0.2～1.0mM，配制不同浓度过氧化氢溶液，做出过氧化氢标准曲线。
3.根据权利要求2所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性时标准曲线的绘制，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：过氧化氢酶及固定化酶溶液中，过氧化氢酶含量为0.5mg mL-1，固定化酶材料为CAT@Tb-BTC，合成方法为原位封装法。
5.根据权利要求4所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法中自由溶液的配制及固定化酶材料的合成，其特征在于：包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：在pH＝5.5，常温条件下，每分钟分解1μmol H2O2时所消耗的酶量定义为1个过氧化氢酶活度单位。
7.根据权利要求6所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：
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【技术特征摘要】
1.一种基于羟基自由基的检测对固定化酶的催化活性评价方法，其特征在于：利用电子顺磁共振波谱法检测溶液中的羟基自由基，从而得到溶液中过氧化氢的浓度，实现对酶活性的测定。
2.根据权利要求1所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：底物过氧化氢浓度范围为0.2～1.0mm，配制不同浓度过氧化氢溶液，做出过氧化氢标准曲线。
3.根据权利要求2所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性时标准曲线的绘制，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的测试过氧化氢酶及固定化过氧化氢酶活性的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，孙烨琳，孙冰楠，张维冰，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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