【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物提取物作用机理研究领域，具体为一种白茶提取物抗氧化及抗黑色素生成的研究方法。
技术介绍
1、中国是茶叶生产、加工和消费大国。根据茶树品种、鲜叶原料、加工工艺、产品特性、生产地域等多种特征，可以将茶叶分为白茶、绿茶、乌龙茶、黑茶、红茶以及黄茶。其中，白茶是以特定茶树品种如大白茶、水仙茶树品种的鲜叶为原料，经萎凋、干燥等生产工艺制成的产品。在六大茶类中，白茶的加工工艺最为简单，不经历促使酶失活的杀青和促使多酚类物质氧化的做青工艺，被认为最为天然，保留了最多的活性物质。
2、2020年6月，国务院颁布《化妆品监督管理条例》，明确指出支持和鼓励运用我国特色植物资源研究开发化妆品。目前，植物提取物在化妆品行业运用广泛，但基础研究的缺乏，导致多数植物提取物的安全性和有效性遭到质疑，行业公认不足，消费者信心受挫。而且，新颁布的《化妆品监督管理条例》强调，化妆品的功效宣称应当有充分的科学依据。这更加需要我们运用现代药理学对具有开发潜力的植物提取物建立完备的功效评价体系，为其在化妆品中的应用提供科学依据。
3、白茶作为来自我国的特色茶叶，独特的加工工艺使得其化学组成不同于其他茶叶品种，具有多种药理学活性，如抗氧化、抗微生物、抗肥胖与糖尿病、抗肿瘤等。尤其是优秀的抗氧化活性为其提供了开发成抗衰老或美白等功能性化妆品的巨大潜力。但是目前仍然缺乏以白茶提取物作为化妆品原料的系统性研究。
4、因此，本领域技术人员提供了一种白茶提取物抗氧化及抗黑色素生成的研究方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。>
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种白茶提取物抗氧化及抗黑色素生成的研究方法，旨在研究白茶提取物对黑色素生成的抑制作用以及抗氧化活性，对白茶提取物进行功效评价，为白茶提取物的开发和在功能性化妆品的应用上提供科学依据，解决了目前国内仍然缺乏以白茶提取物作为化妆品原料的系统性研究的问题。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
5、一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，包括以下过程：
6、步骤s1.材料准备
7、选择白茶提取物1号与白茶提取物2号作为实验对象，并且准备茶多酚、dpph自由基清除能力试剂盒与羟自由基测试试剂盒、dmem培养基、胰蛋白酶、青霉素与链霉素、胎牛血清、其他化学纯有机和无机试剂、hff-1人皮肤成纤维细胞等原料；
8、步骤s2.dpph自由基清除率的测定
9、以ddh2o为溶剂，配制系列梯度质量浓度的待测样品溶液，并根据dpph自由基清除能力试剂盒说明书，按下表1所示配比在ep管中进行加样：
10、表1dpph自由基清除率测定加样表
11、
12、加样后混合均匀，在室温下避光静置30min，然后以4000r/min离心5min后，96孔板每孔加样60μl，每一浓度测定组每组平行3孔，对照1孔，使用酶标仪，在517nm测各孔的吸光度值。再按下式计算dpph自由基清除率：
13、
14、步骤s3.羟基自由基清除率的测定
15、以ddh2o为溶剂，配制系列梯度质量浓度的待测样品溶液，并根据羟自由基测试试剂盒说明书配制工作试剂，按下表2所示配比在96孔板中加样：
16、表2羟基自由基清除率测定加样表
17、
18、加样后混合均匀，在室温下放置20分钟，使用酶标仪，在550nm测各孔的吸光度值，再按下式计算羟基自由基清除率：
19、
20、步骤s4.hff-1人皮肤成纤维细胞培养
21、1)细胞复苏：从液氮罐中取出含有1ml hff-1细胞悬液的冻存管，立即放入37℃的水浴锅中解冻，再将细胞悬液转移至离心管中并加入5ml培养基混合均匀，1000rpm离心5min，弃去上清液，并加入含15％胎牛血清的dmem培养基重悬，转移至培养皿，在37℃、5％co2条件的培养箱中培养；
22、2)细胞传代：上述培养4-6天后，当细胞密度在80％-90％之间时，进行细胞传代；
23、从细胞培养箱中取出培养皿，弃去培养皿中的上清液，用pbs冲洗，加入2ml的0.25％胰酶，于培养箱中消化1-2min，在显微镜下观察消化情况，当细胞变圆且不再贴壁时，迅速加入dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，当细胞完全脱落时，将细胞液转移至离心管中1000rpm离心5min，弃去上清液，加入dmem培养基重悬细胞，弃去部分重悬液后，将剩余部分转移至培养皿中，补加足量的dmem培养基，置于37℃、5％co2的培养箱中培养；
24、3)细胞冻存：从细胞培养箱中取出培养皿，弃去培养皿中的上清液，用pbs冲洗，加入2ml的0.25％胰酶，于培养箱中消化1-2min，在显微镜下观察消化情况，当细胞变圆且不再贴壁时，迅速加入dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，当细胞完全脱落时，将细胞液转移至离心管中1000rpm离心5min，弃去上清液，加入50％dmem完全培养基、40％胎牛血清和10％的dmso，将细胞悬液转移至冻存管中，放入冻存盒，在-80℃冰箱中放置24h后，将冻存管转移至液氮中。
25、步骤s5.白茶提取物对氧化损伤细胞的修复作用
26、1)h2o2诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤模型建立；
27、2)对氧化损伤细胞的修复作用。
28、步骤s6.进行数据统计
29、采用graphpad prism 9软件进行数据统计、差异性分析及作图，并将实验数据在图表中以均值±sem表示，差异性分析使用anova方法，p＜0.05即为有统计学差异；图中*表示p＝0.01-0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001。
30、进一步地，所述hff-1人皮肤成纤维细胞选自细胞库。
31、进一步地，所述步骤s1中的材料准备还包括实验仪器准备，所述准备仪器包括thermo 96孔板细胞培养板，eppendorf各量程移液器，eppendorf 5910r离心机，eppendorf5427r离心机，phenix正置显微镜，haier垂直层流洁净工作台，sartorius天平，siemens冰箱，dhg烘箱，thermo细胞培养箱，biotech多功能酶标仪。
32、进一步地，所述步骤s5中的h2o2诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤模型建立具体包括：
33、①、取对数生长期的hff-1细胞，用0.25％胰酶常规消化，收集细胞悬液离心后加入适量dmem完全培养基重悬细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度为5.0×104个/ml，每孔100μl接种于96孔板中，置于37℃、5％co2条件下的细胞培养箱中培养24hr；
34、②、取出96孔板，吸去原培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，包括以下过程：
2.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述HFF-1人皮肤成纤维细胞选自细胞库。
3.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述步骤S1中的材料准备还包括实验仪器准备，所述准备仪器包括Thermo 96孔板细胞培养板，Eppendorf各量程移液器，Eppendorf 5910R离心机，Eppendorf 5427R离心机，Phenix正置显微镜，Haier垂直层流洁净工作台，sartorius天平，SIEMENS冰箱，DHG烘箱，Thermo细胞培养箱，Biotech多功能酶标仪。
4.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述步骤S5中的H2O2诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤模型建立具体包括：
5.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述步骤S5中的对氧化损伤细胞的修复作用具体包括：
6.一种白茶提取物抗黑色素生成的研究方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的一种白茶提取物抗黑色素生成的研究方法，其特征在于，所述B16小鼠黑色素瘤细胞选自细胞库。
8.根据权利要求6所述的一种白茶提取物抗黑色素生成的研究方法，其特征在于，所述步骤1中的材料准备的实验仪器与步骤S1中准备的实验仪器区别在于多使用了Thermo 6孔板细胞培养板。
...【技术特征摘要】
1.一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，包括以下过程：
2.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述hff-1人皮肤成纤维细胞选自细胞库。
3.根据权利要求1所述的一种白茶提取物抗氧化活性研究方法，其特征在于，所述步骤s1中的材料准备还包括实验仪器准备，所述准备仪器包括thermo 96孔板细胞培养板，eppendorf各量程移液器，eppendorf 5910r离心机，eppendorf 5427r离心机，phenix正置显微镜，haier垂直层流洁净工作台，sartorius天平，siemens冰箱，dhg烘箱，thermo细胞培养箱，biotech多功能酶标仪。
4.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱岗，别玮，顾佳，
申请(专利权)人：上海松皓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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