【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫检测，尤其涉及一种猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。
技术介绍
1、目前，猪细小病毒(porcine parvovirus,ppv)是引起母猪繁殖障碍的常见重要病原体之一，且存在众多基因型。
2、ppv7是单股线性dna病毒，基因组大小约为4kb，ppv7与ppv1～6基因组同源性较低，包含2个开放阅读框，其中orf2编码病毒衣壳蛋白cap，是ppv7主要免疫原性蛋白，能够诱导抗病毒感染的特异性中和抗体，在病毒感染和复制中发挥着重要作用。
3、目前新发现的ppv7的研究报道多集中在核酸检测，elisa血清学检测相比于病原学检测具有操作简便和高通量的优点，因此在养殖场的大规模检测中应用更加广泛。
4、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前缺乏有效疫苗和特异性治疗方法，针对ppv7的防控只能依赖严格的检疫诊断措施。现有ppv7核酸检测方法对操作人员要求较高，检测成本较大，且需要相应的仪器设备和操作环境，不适于基层养殖场的大规模检测。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体特异性结合猪细小病毒7型cap蛋白，抗体重链可变区序列如seq idno:2所示，其轻链可变区序列如seq id no:3所示。
3、
4、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
5、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
6、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白类型为igg，结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成y字形结构；轻链n端1～108个氨基酸序列多边，称为轻链可变区vl，重链n端1～130个氨基酸组成多变，称为重链可变区hl，在vl和hl中各有3个区域的氨基酸组成变化更大，称为高变区，高变区构成了与抗原b细胞表位特异互补结合的构型。
7、本专利技术的另一目的在于提供一种所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的制备方法，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
8、第一步，将纯化后的cap蛋白与弗氏佐剂混合，乳化成疫苗，皮下接种6～8周龄的雌性balb/c小鼠，每只小鼠免疫100μg，共免疫4次，四免后一周尾静脉采集小鼠血液，分离血清，通过间接elisa检测血清cap蛋白抗体效价，选取抗体水平较高的小鼠进行细胞融合；
9、第二步，取加强免疫后3d的balb/c小鼠经眼球摘除放血致死且收集阳性血清以备用；无菌取出小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞并与sp2/0细胞混合，在37℃水浴条件下加入1mlpeg-1500使两种细胞融合，加入含有hat、10％胎牛血清的1640培养基，将细胞均匀的铺至96孔细胞培养板中，放在37℃、5％co2培养箱中培养；
10、第三步，于细胞融合后的第7天，用含ht的培养基对融合的细胞进行半量换液，融合后的第9天用含ht的培养基对融合的细胞进行全量换液，融合后的第11天，用间接elisa方法测细胞上清抗体效价，重复测2次，将稳定分泌抗体的孔进行2～3次亚克隆，用间接elisa方法测细胞效价，直至筛选出能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞3d10；
11、第四步，选取8-12周龄的balb/c小鼠，提前7d向腹腔注射不完全弗氏佐剂，每只500μl，7d后把筛选出的单克隆细胞800rpm，离心10min，弃上清，用pbs重悬，进行活细胞计数，每只小鼠注射1×106个单克隆细胞至腹腔。7～10d后用无菌注射器抽取小鼠腹水，12000rpm，离心30min；用protein g亲和层析纯化腹水。
12、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的制备方法的猪细小病毒7型cap蛋白的制备，截取ppv7 cap蛋白全长碱基序列，根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，在其n端和c端分别引入ndeⅰ和xhoⅰ限制性核酸内切酶，合成并克隆至pet28a表达载体，获得重组载体，转入bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆并加入iptg进行诱导表达，保存表达量较高的重组菌株；
13、活化重组菌株被制备成感受态，将表达伴侣蛋白pgro7的质粒转入重组细胞中，利用抗性标记对阳性克隆进行筛选，建立共表达体系；
14、将重组菌株1:100接种于lb培养基，加入相应抗生素和1mg/ml的阿拉伯糖，37℃、220rpm培养2h，诱导gro7蛋白的表达，然后加入0.1mm iptg，30℃、220rpm培养12h，诱导cap蛋白的表达；诱导结束后取出培养瓶，离心收集菌体，用pbs清洗2次后将菌体重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心分离上清和沉淀，上清用来纯化可溶性cap蛋白，沉淀用适量pbs重悬后留作sds-page检测样品。
15、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的制备方法的sds-page和westernblot检测蛋白诱导情况，然后用硫酸铵粗纯和亲和层析两步法纯化目的蛋白；
16、首先用梯度硫酸铵沉淀法确定目的蛋白盐析所需的饱和硫酸铵浓度，蛋白析出沉淀用适量pbs溶解并透析，经0.22μm滤膜过滤后置于冰上或4℃暂存；ni-excel亲和介质经平衡液平衡后，将过滤后的细胞培养上清以1ml/min的流速在4℃条件下结合，用20倍柱体积的平衡液洗去未结合的蛋白，然后用20倍柱体积含有30mm咪唑的溶液洗去与ni填料结合能力差的杂蛋白，最后用含100mm咪唑的平衡液配置成的洗脱缓冲液对结合的重组蛋白进行洗脱；
17、纯化蛋白的sds-page检测，使用bca法测定蛋白浓度，取部分纯化后的蛋白，加入5×上样缓冲液混合后煮沸10min变性，经12％sds-page凝胶电泳分离蛋白样品后使用考马斯亮蓝溶液进行染色，脱色完成后使用凝胶成像系统进行观察，结果显示纯化后的重组蛋白分子量为54kd。
18、进一步，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的制备方法的单克隆抗体的检测用间接elisa的方法，包被抗原为原核表达纯化的cap蛋白，包被浓度为10μg/孔，并设阴性孔和阳性孔对照，将单克隆抗体倍比稀释作为一抗，以od450值大于阴性孔3倍为阳性判定标准，测定单克隆抗体的效价为1:1024000；
19、单克隆抗体类型和亚型检测：使用商品化单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体3d10的亚型进行鉴定，结果显示3d10的重链为igg1，轻链为kappa；
20、单克隆抗体可变区序列的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述Cap蛋白是通过伴侣蛋白GRO7共表达的方法由原核表达系统制备的；其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
5.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白类型为IgG，结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成Y字
6.一种如权利要求1～5任意一项所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的猪细小病毒7型Cap蛋白的制备，截取PPV7 Cap蛋白全长碱基序列，根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，在其N端和C端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶，合成并克隆至pET28a表达载体，获得重组载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并加入IPTG进行诱导表达，保存表达量较高的重组菌株；
8.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白诱导情况，然后用硫酸铵粗纯和亲和层析两步法纯化目的蛋白；
9.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的单克隆抗体的检测用间接ELISA的方法，包被抗原为原核表达纯化的Cap蛋白，包被浓度为10μg/孔，并设阴性孔和阳性孔对照，将单克隆抗体倍比稀释作为一抗，以OD450值大于阴性孔3倍为阳性判定标准，测定单克隆抗体的效价为1:1024000；
10.一种如权利要求1～5任意一项所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体在猪细小病毒7型Cap蛋白检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体特异性结合猪细小病毒7型cap蛋白，抗体重链可变区序列如seq id no:2所示，其轻链可变区序列如seq id no:3所示。
2.如权利要求1所述的猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述cap蛋白是通过伴侣蛋白gro7共表达的方法由原核表达系统制备的；其碱基序列如seq id no:1所示。
3.如权利要求1所述的猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
5.如权利要求1所述的猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白类型为igg，结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成y字形结构；轻链n端1～108个氨基酸序列多边，称为轻链可变区vl，重链n端1～130个氨基酸组成多变，称为重链可变区hl，在vl和hl中各有3个区域的氨基酸组成变化更大，称为高变区，高变区构成了与抗原b细胞表位特异互补结合的构型。
6.一种如权利要求1～5任意一项所述猪细小病毒7型cap蛋白单克隆抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：姬鹏超，蒋大伟，王盼盼，刘博远，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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