【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检测，尤其涉及一种基于lamp-crispr-cas12b体系检测弓形虫的方法及其应用。
技术介绍
1、弓形虫病(toxoplasmosis)是一种由专性细胞内寄生的弓形虫(toxoplasmagondii)引起的人畜共患寄生虫病。弓形虫的中间宿主包括人、畜、禽和许多野生动物，终末宿主是猫及猫科动物，弓形虫的卵囊具有感染性，会随猫科动物的粪便一同排出，在经过氧化作用孢子化后有很强的环境抗性，能够污染水源、土壤、果蔬等。人可因食入被卵囊污染的食物和水而感染，刚地弓形虫可感染包括人在内的几乎所有温血动物。大多数健康的人感染弓形虫后无明显症状而呈隐性感染状态，但感染具有潜伏性，且能长期存活于宿主体内，例如寄生于大脑和肌肉中；当健康的个体因外界因素导致免疫功能下降时，体内的包囊被激活转化为速殖子造成急性感染；先天免疫功能低下者感染可危及生命，其中最严重的表现是脑炎和脑脓肿。另外，妊娠妇女感染后可能导致胎儿先天性弓形虫病，其危害主要表现为胎儿严重畸形和自然流产；或新生儿出生时虽无症状，但在以后的生活中会伴有学习障碍、精神疾病和眼病等。
2、研究表明，人类急性弓形虫病的暴发与环境中卵囊污染有关，主要通过摄入被弓形虫卵囊污染的食物或接触被卵囊污染的土壤或地表水而感染。环境中的孢子化卵囊具有很强的生命力，它们能抵抗不利的环境因素和化学侵蚀，在水中能存活54个月，在土壤中可存活达24个月之久。因此，对环境中的弓形虫卵囊进行高效检测具有重要的现实意义。
3、目前，弓形虫病的诊断方法主要分为病原学方法、免疫学
4、lamp技术是一种可以在体外对核酸进行恒温扩增的技术。该方法只需要一种高置换链活性的dna聚合酶和一套特殊引物就可以在等温条件(60-65℃)下对靶标基因进行快速扩增。已有研究采用pcr和lamp对伊朗阿瓦士公园土壤中的犬弓首蛔虫和猫弓首蛔虫进行了检测，结果发现lamp的检测率明显高于pcr，因此lamp比普通pcr更灵敏。但是由于其超高的灵敏度，导致检测时可能出现假阳性。cas12b是一种双rna导向的核酸内切酶，属于crispr系统中class2 type v家族内的一种耐热性蛋白，识别的pam序列为5'-ttn-3'。且cas12b蛋白与cas12a蛋白同样具有在切割靶标dna后会激活反式切割的活性，在此基础上开发了基于cas12b的核酸检测系统。
5、目前已有将crispr-cas12b与lamp技术结合开发的holmesv2检测系统，在同一体系中实现对靶标的扩增和检测，从而降低了样本间交叉污染的风险性并提高了特异性。本研究参考holmesv2方法，建立一种基于lamp-crispr-cas12b体系可视化检测环境中弓形虫的方法，与现在已经成熟的核酸检测装置侧流免疫层析技术结合，开发出更便携、信号读取更容易的弓形虫检测方法，并且进行了初步应用。该方法设计简单，成本低，检测速度快，对靶标核酸的灵敏度和特异性的水平都很高，是非常有发展前景的弓形虫检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.37所示。
2、本专利技术的又一目的在于提供一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的试剂，所述试剂中含有上述sgrna。
3、本专利技术的又一目的在于提供一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的产品，所述产品中含有上述sgrna或试剂。
4、优选地，所述产品为试剂盒。
5、更优选地，所述试剂盒中含有cas12b蛋白、荧光基团和淬灭基团双标记的dna探针，以及用于lamp反应的引物；所述lamp反应的引物序列如seq id no.25-30所示。
6、本专利技术的又一目的在于提供上述sgrna和lamp反应的引物在制备弓形虫检测产品中的应用。
7、优选地，所述产品为试剂盒。
8、更优选地，所述试剂盒的使用方法如下：
9、(1)制备样本核酸模板；
10、(2)使步骤(1)获得的核酸模板、cas12b蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的dna探针，以及所述sgrna分子在crispr-cas12b反应体系里反应；
11、(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
12、优选地，所述步骤(1)中样本核酸模板由lamp反应获得。
13、更优选地，所述lamp反应的温度为55℃，反应时间为20min。
14、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
15、本专利技术是一种基于lamp-crispr-cas12b技术的弓形虫检测工具，它具有便携性和高效性的特点。这种工具包含了一个侧流层析试纸条，可以方便、快速地提供肉眼可见的检测结果。这种方法在等温条件下进行，不需要专业的实验室设备，非常适合在野外环境中进行快速和准确的检测。因此，它为基层监控和诊断弓形虫感染提供了一个有效的技术手段。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12b体系检测弓形虫核酸的SgRNA，其特征在于，所述SgRNA的序列如SEQ ID NO.37所示。
2.一种基于CRISPR-Cas12b体系检测弓形虫核酸的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1中所述的SgRNA。
3.一种基于CRISPR-Cas12b体系检测弓形虫核酸的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1中所述的SgRNA或权利要求2中所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中含有Cas12b蛋白、荧光基团和淬灭基团双标记的DNA探针，以及用于LAMP反应的引物；所述LAMP反应的引物序列如SEQID NO.25-30所示。
6.权利要求1中所述的SgRNA和权利要求5中所述的LAMP反应的引物在制备弓形虫检测产品中的应用。
7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：p>
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中样本核酸模板由LAMP反应获得。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述LAMP反应的温度为55℃，反应时间为20min。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列如seq id no.37所示。
2.一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1中所述的sgrna。
3.一种基于crispr-cas12b体系检测弓形虫核酸的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1中所述的sgrna或权利要求2中所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中含有cas12b蛋白、荧光基团和淬灭...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱兴全，梁瑶，贺渊惠，郑文斌，郑晓楠，高文伟，刘卿，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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