【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，尤其是利用一种晶胶层析技术从猪胰脏中分离磷脂酶a2（phospholipasea2）的方法。
技术介绍
1、磷脂酶a2（phospholipasea2）是一种参与脂质代谢、水解磷脂并释放花生四烯酸和溶血磷脂的酶蛋白，具有直接抗菌活性，在炎症型疾病治疗中有重要作用。通过磷脂酶a2水解生成的脂肪酸可被进一步转化作为活性脂质参与生理过程，在调节细胞内外的代谢中起着关键作用。
2、磷脂酶a2（phospholipasea2）广泛存在于各种动物组织，尤其是动物毒液及哺乳动物的胰脏分泌液中。但是磷脂酶a2分离纯化难度较高，现有的分离工艺往往需要结合多次的重复盐析、凝胶层析、亲和层析等多个步骤完成，过程复杂，副产物多，分离纯度低。
3、晶胶介质内部存在大量的相互连通的超大孔隙，具有优良的机械性能、较小的传质阻力、优异的生物相容性、简单的分离操作等优点，在生物分离领域具有广阔的应用前景。目前尚无利用晶胶介质从猪胰脏粗酶液中分离磷脂酶a2的相关文献报道。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法。
2、具体的技术方案如下：
3、一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，包括如下步骤：
4、1）上样，将含磷脂酶a2的粗酶液ph调至4.9~8.0作为上样液，以流速0.5~5 cm/min通过晶胶介质进行上样吸附；
5、2）冲洗，用ph为4.9~8
6、3）洗脱，用缓冲溶液作为洗脱液进行洗脱，收集含目标蛋白磷脂酶a2的洗脱峰，所收集到的洗脱液为提纯后的磷脂酶a2；
7、4）晶胶再生，先用含有2 mnacl的ph为4.9~8.0的缓冲溶液作为再生液对晶胶介质进行再生，再用大量去离子水冲洗。
8、进一步地，步骤1）中的含磷脂酶a2的粗酶液是将新鲜猪胰脏预处理后得到的，猪胰脏预处理的步骤是将猪胰脏去除表面脂肪和结缔组织，并用去离子水洗净，加入预冷至4℃的ph=2.0~4.0的乙酸溶液，优选ph=2.5，以转速18000 rpm、每次30 s、4次共计120 s进行搅拌；将得到的混合液置于4 ℃冷藏2~7 h，搅拌；将混合液以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件离心8~20 min，取上清用5m hcl调ph至2.5，在4 ℃下静置沉淀0.5~4.0 h后，以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件再离心8~20 min，得到的上清液即为含磷脂酶a2的粗酶液。
9、进一步地，步骤1）中的晶胶介质为内嵌细菌纤维素的聚甲基丙烯酸羟乙酯整体晶胶介质，带有磺酸基阳离子交换功能基团。
10、进一步地，步骤1）中的晶胶介质的内部孔径为10~300 μm，孔隙间相互连通。
11、进一步地，步骤3）中的洗脱步骤为梯度洗脱，洗脱液流速为0.5~5 cm/min，先用含有0.05~0.1mnacl的ph为4.9~8.0的缓冲溶液洗脱杂质，再用含0.3~0.5mnacl的ph为4.9~8.0的缓冲溶液洗脱目标蛋白磷脂酶a2，最后用含0.5~1.0mnacl的ph为4.9~8.0的缓冲溶液再次洗脱残留的目标蛋白磷脂酶a2，收集含目标蛋白磷脂酶a2的洗脱峰，得到所述的提纯后的磷脂酶a2。
12、进一步地，缓冲溶液为ph= 4.9~8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为5~50 mm。
13、优选地，一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，包括如下步骤：
14、1）以ph值为4.9~8.0的磷酸盐缓冲液对带有磺酸基阳离子交换功能基团的晶胶介质进行平衡；
15、2）将猪胰脏处理后的含磷脂酶a2的粗酶液ph调至4.9~8.0作为上样液，以0.5~5cm/min的流速上样；
16、3）用ph为4.9~8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗晶胶介质，以0.5~5 cm/min的流速冲洗晶胶孔隙内游离的磷脂酶a2和未被吸附的杂质；
17、4）用含有0.05~1.0 m的nacl的ph4.9~8.0的磷酸盐缓冲溶液作为洗脱液，进行梯度洗脱，洗脱流速为0.5~5 cm/min，收集含目标蛋白磷脂酶a2的洗脱峰，得到所述的磷脂酶a2；
18、5）依次用含2 m nacl的ph为4.9~8.0的缓冲溶液和去离子水对晶胶介质再生。
19、本专利技术的有益效果在于：
20、本专利技术利用内部含有超大孔隙的晶胶介质层析分离，实现了磷脂酶a2的直接分离，将现有的磷脂酶a2分离工艺过程中的多次重复盐析、凝胶层析和超滤等多个结合或复杂的步骤简化为通过晶胶层析一步实现；流程简便，成本低廉，分离得到的磷脂酶a2纯度高。
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1.一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤1）中的含磷脂酶A2的粗酶液是将新鲜猪胰脏预处理后得到的，猪胰脏预处理的步骤是将猪胰脏去除表面脂肪和结缔组织，并用去离子水洗净，加入预冷至4 ℃的pH=2.0~4.0的乙酸溶液，优选pH=2.5，以转速18000 rpm、每次30 s、4次共计120 s进行搅拌；将得到的混合液置于4 ℃冷藏2~7 h，搅拌；将混合液以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件离心8~20 min，取上清用5MHCl调pH至2.5，在4 ℃下静置沉淀0.5~4.0 h后，以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件再离心8~20 min，得到的上清液即为含磷脂酶A2的粗酶液。
3.如权利要求1所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤1）中的晶胶介质为内嵌细菌纤维素的聚甲基丙烯酸羟乙酯整体晶胶介质，带有磺酸基阳离子交换功能基团。
4.如权利要求1或3所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤
5.如权利要求1所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤3）中的洗脱步骤为梯度洗脱，洗脱液流速为0.5~5 cm/min，先用含有0.05~0.1MNaCl的pH为4.9~8.0的缓冲溶液洗脱杂质，再用含0.3~0.5MNaCl的pH为4.9~8.0的缓冲溶液洗脱目标蛋白磷脂酶A2，最后用含0.5~1.0MNaCl的pH为4.9~8.0的缓冲溶液再次洗脱残留的目标蛋白磷脂酶A2，收集含目标蛋白磷脂酶A2的洗脱峰，得到所述的提纯后的磷脂酶A2。
6.如权利要求1所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，缓冲溶液为pH=4.9~8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为5~50 mM。
7.如权利要求1所述的一种磷脂酶A2的晶胶层析分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤1）中的含磷脂酶a2的粗酶液是将新鲜猪胰脏预处理后得到的，猪胰脏预处理的步骤是将猪胰脏去除表面脂肪和结缔组织，并用去离子水洗净，加入预冷至4 ℃的ph=2.0~4.0的乙酸溶液，优选ph=2.5，以转速18000 rpm、每次30 s、4次共计120 s进行搅拌；将得到的混合液置于4 ℃冷藏2~7 h，搅拌；将混合液以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件离心8~20 min，取上清用5mhcl调ph至2.5，在4 ℃下静置沉淀0.5~4.0 h后，以转速6000~12000 rpm、4 ℃的条件再离心8~20 min，得到的上清液即为含磷脂酶a2的粗酶液。
3.如权利要求1所述的一种磷脂酶a2的晶胶层析分离方法，其特征在于，步骤1）中的晶胶介质为内嵌细菌纤维素的聚甲基丙烯酸羟乙酯整体晶胶介质，带有磺酸基阳离子交...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈绍传，黄甜甜，张文静，楼小玲，贠军贤，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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