【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及用于微生物发酵中卟啉类化合物检测的前处理方法、微生物发酵中卟啉类化合物的检测方法以及微生物发酵中卟啉类化合物的提取方法。
技术介绍
1、血红素是一种卟啉衍生物，含有亚铁离子和卟啉类化合物结构。血红素作为包括血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素p450和细胞色素c在内的血红素蛋白的重要辅基，分别在氧转移、氧储存、氧活化和电子转移中发挥重要作用(请参见shimizu t,lengalova a,martínek v等，heme:emergent roles of heme in signal transduction,functionalregulation and as catalytic centres，chemical society reviews，2019,48(24):5624-5657；在此将其以引用的方式整体并入本文)。血红素被广泛应用于医疗保健领域，用于缺铁以及急性间歇性缺铁的治疗等。近年来，随着人造肉技术的出现，血红素成为人造肉不可缺少的调味物质。然而，血红素的高效生产是制约人造肉产业发展的瓶颈之一。传统的血红素制备方法主要以动物血液和植物的化学提取为主，具有效率低、环境污染和可持续性的问题。随着合成生物学的发展，许多研究人员尝试通过微生物发酵的方式生产血红素。
2、到目前为止，已经发现了三种微生物合成血红素的途径，分别是原卟啉途径(protoporphyrin pathway)[粪卟啉原iii(coproporphyrinogen iii)→原卟啉原ix(protopo
3、为了使微生物发酵生产血红素能够得到工业化应用，高效的血红素及其前体卟啉类化合物(以下统称为卟啉类化合物)的提取、前处理以及检测方法是必不可少的。
4、在本工作之前，尚未有针对复杂的微生物发酵体系中卟啉类化合物的提取方法进行系统研究，因此本领域需要对复杂的微生物发酵体系(包括微生物胞内以及发酵液)中的卟啉类化合物的快速且简单的提取方法以及检测方法。
技术实现思路
1、为了上述目的，本申请提供了微生物发酵体系中的卟啉类化合物(包括血红素及其前体卟啉类化合物)的提取和前处理方法。
2、在一个方面，本申请提供了用于来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品的前处理方法，所述前处理方法包括：使所述样品与酸性丙酮进行接触。
3、在实施方式中，所述酸性丙酮的ph值小于2.9。
4、在一些实施方式中，所述来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品可包括微生物细胞样品或其经加工的样品，和发酵液样品或其经加工的样品，或其混合物。
5、在一些实施方式中，所述来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品可为直接来自微生物发酵体系的样品或其经加工的样品，其中，包括微生物细胞以及发酵液。在一些实施方式中，对直接来自微生物发酵体系的样品进行离心和/或静置沉淀等加工，以获得经加工的样品。
6、在一些实施方式中，所述来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品可为微生物细胞样品或其经加工的样品。在一些实施方式中，所述来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品可为发酵液样品或其经加工的样品。
7、在优选的实施方式中，本专利技术所述的前处理方法可进一步包括，对所述接触步骤得到的混合物进行任选地分离以及干燥的步骤，以及对干燥的卟啉类化合物进行重溶的步骤。在实施方式中，用于重熔的溶剂取决后后续的处理方式，例如，可用酸性丙酮或dmso等。
8、本专利技术所述的前处理方法尤其适合于生产卟啉类化合物的微生物的工业发酵体系。在最优选的实施方式中，本专利技术所述的前处理方法特别适用于对高产卟啉类化合物的微生物发酵体系，例如卟啉类化合物的产量在100mg/l以上、200mg/l以上、优选1000mg/l以上、更优选3000mg/l以上。
9、在一个方面，本申请提供了微生物发酵体系中的卟啉类化合物的检测方法，所述检测方法包括：使用根据本专利技术上述的前处理方法对来自所述微生物发酵体系的样品进行前处理，然后对前处理样品中的卟啉类化合物进行测量。
10、在一些实施方式中，用hplc、分光光度法、全光谱扫描等对所述前处理后的样品中的卟啉类化合物进行测量。
11、用本专利技术所述的前处理方法得到的样品可直接用于卟啉类化合物的测量，例如通过hplc进行的测量(如定性或定量)，而无需进一步的处理。
12、在一个方面，本申请提供了对微生物发酵体系中的卟啉类化合物进行提取的方法，所述提取方法包括以下中的一个或多个步骤：
13、i)向微生物发酵体系中添加酸性丙酮进行细胞破碎和/或提取卟啉类化合物；
14、ii)用酸性丙酮对卟啉类化合物沉淀进行重溶。
15、在实施方式中，所述酸性丙酮的ph值小于2.9。
16、在一些实施方式中，所述微生物发酵体系可选自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系，例如，包括微生物细胞样品或其经加工的样品，和发酵液样品或其经加工的样品，或其混合物。
17、在一些实施方式中，可对直接来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品或其经加工的样品进行提取，其中，所述样品包括微生物细胞以及发酵液。在一些实施方式中，对直接来自微生物发酵体系的样品进行离心和/或静置沉淀等加工，以获得经加工的样品。
18、在一些实施方式中，可对生产卟啉类化合物的微生物细胞样品或其经加工的样品进行提取。在一些实施方式中，可对来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的发酵液或其经加工的样品进行提取。
19、在一些实施方式中，本申请提供了对来自微生物发酵体系的样品中的卟啉类化合物进行提取的方法，所述提取方法包括：向所述样品中添加酸性丙酮进行细胞破碎和/或提取卟啉类化合物；对所述提取物进行任选的离心和过滤；以及，进行干燥以获得所述卟啉类化合物。在优选的实施方式中，所述提取方法包括用溶剂对所述干燥的卟啉类化合物进行重溶。例如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品的前处理方法，所述前处理方法包括：使所述样品与酸性丙酮进行接触。
2.一种微生物发酵体系中的卟啉类化合物的检测方法，所述检测方法包括：使用如权利要求1所述的前处理方法对来自所述微生物发酵体系的样品进行前处理，然后对前处理样品中的卟啉类化合物进行测量。
3.一种对微生物发酵体系中的卟啉类化合物进行提取的方法，所述提取方法包括以下中的一个或多个步骤：
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法中，其中，所述卟啉类化合物包括血红素以及其生物合成过程中的前体卟啉类化合物；优选地，所述卟啉类化合物包括以下中的一种或多种：粪血红素、粪卟啉原III、粪卟啉III、原卟啉原IX、原卟啉IX、尿卟啉原III、尿卟啉III、尿卟啉原I、尿卟啉I、粪卟啉原I、粪卟啉I。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法中，其中，所述微生物为来自变形菌门的微生物，优选来自α变形菌纲的微生物，更优选来自红细菌属的类球红细菌；
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法中，其中，所述酸性丙酮pH值小于2.9、更优
7.如权利要求1或2所述的方法中，其中，所述酸性丙酮与所述微生物发酵体系的发酵液上清的体积比为1:2以上、优选1:1以上、更优选1:1-3:1；或者，
8.如权利要求1或2所述的方法中，其中，所述前处理方法进一步包括，对所述接触步骤得到的混合物进行任选地分离以及干燥的步骤，以及对干燥的卟啉类化合物进行重溶的步骤；优选地，用于重溶的溶剂为酸性丙酮或DMSO。
9.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述提取方法包括：向所述样品中添加酸性丙酮进行细胞破碎和/或提取卟啉类化合物；对所述提取物进行任选的离心和过滤；以及，进行干燥以获得所述卟啉类化合物；或者
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述沉淀剂为冰醋酸或碱性溶剂；优选地，所述碱性溶剂为氢氧化钠溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种用于来自生产卟啉类化合物的微生物发酵体系的样品的前处理方法，所述前处理方法包括：使所述样品与酸性丙酮进行接触。
2.一种微生物发酵体系中的卟啉类化合物的检测方法，所述检测方法包括：使用如权利要求1所述的前处理方法对来自所述微生物发酵体系的样品进行前处理，然后对前处理样品中的卟啉类化合物进行测量。
3.一种对微生物发酵体系中的卟啉类化合物进行提取的方法，所述提取方法包括以下中的一个或多个步骤：
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法中，其中，所述卟啉类化合物包括血红素以及其生物合成过程中的前体卟啉类化合物；优选地，所述卟啉类化合物包括以下中的一种或多种：粪血红素、粪卟啉原iii、粪卟啉iii、原卟啉原ix、原卟啉ix、尿卟啉原iii、尿卟啉iii、尿卟啉原i、尿卟啉i、粪卟啉原i、粪卟啉i。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法中，其中，所述微生物为来自变形菌门的微生物，优选来自α变形菌纲的微生物，更优选来自红细菌属的类球红细菌；
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法中，其中，所述酸性丙酮p...
【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，谭高翼，陈海红，王为善，王正铎，曹婷，吕东源，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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