通过胚胎发生法使向日葵再生的方法技术

从未成熟胚胎出发的栽培品再生的方法，它包括三个阶段：—在含有一种细胞激动素型激素的培养基中胚胎发生胼胝体的形成。—在与前述同样性质的一种培养基中胼胝体的培养。—胚芽的培养。应用于向日葵栽培品种。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一项以细胞或组织开始通过体细胞胚胎发生法使向日葵植株再生的方法。本专利技术也涉及借助于这项方法产生的向日葵植株和种子。尽管我们已能从分离的细胞或组织出发使许多栽培品种的植株获得再生，但以向日葵(Helianthus annuus)进行的种种努力经常总是徒劳无益的。有关通过体细胞胚胎发生法使向日葵再生的数种方法在文献资料中曾有描述，但这些方法仅涉及稀有基因型，或杂交种。取下之活的植物组织是放在第一培养基中培植，这种培养基诱导胼胝体的形成。接着，胼胝体被转移到第二培养基中，这种培养基诱导体细胞胚胎和胚芽的形成。然后，胚芽被转移到第三培养基中，这种培养基诱导根部的形成，而在此阶段，可将再生的植株栽植入土中。佩特森(Paterson)和埃弗雷特(Everett)[植物科学(Plant Sci.，)1985，42，125]配制了一种培养基，经乔治伊娃(Georgieva)、托多洛娃(Todorva)等人确定配制了最佳培养基[第九届国际向日葵学术讨论会论文集(Proc.9th Int.Sconflower Conference，托雷莫利诺斯，西班牙，1980，122)]，此培养基从胚轴的片段出发借助于体细胞胚胎法而诱导向日葵的一种栽培品种(SS415B)的再生。取下之活的植物组织置于黑暗中培养2周，接着在光照下培养2～4周，所使用的是一种改性的穆拉布格和斯库格(MS)培养基，补充以40毫克/升的硫酸腺嘌呤、1毫克/升的6-苄氨基嘌呤(BAP)、1毫克/升的萘乙酸(ANA)和0.1毫克/升的赤雷素(GA3)。在头两周期间，有一种易粉碎的胼胝体的形成，在光照下观察到绿色的斑点出现，它会转变成芽。通过一项解剖研究揭示了这些绿色斑点是类似于接合子胚胎的体细胞胚胎。钱德勒(Chanuder)和简[农业文摘(Agronomy Abstr.，1983，58)]叙述了从来自种间杂交的未成熟胚胎出发的向日葵的再生。未成熟的胚胎(4～5天)是置于由钱德勒(Chandler)和比尔德(Beayd)所描述的为抢救胚胎的生长培养基中[作物科学(Crop Sci.，1983，23 1004)]。经2～3周之后，变大的胚胎被转移到以MS培养基为基质的带有植物生长激素和细胞激素可变剂量的各种不同配方中。在这些培养基中，植物的生产遵照不同的途径，包括直接发芽或诱导胼胝体后续器管发生或胚胎发生。最好的结果是用液体在0～1ppm之间的吲哚乙酸(AIA)和激素而获得的。此系统的优点是从一个孤单胚胎出发进行无性繁植系的多种生产。库利(Coodey)和威尔科克斯(Wilcox)(欧洲专利申请0172377)提出一项应用于栽培向日葵植物品种HA89和RHA274的方法，其中包括上述的三个阶段，并在三种不同的培养基中进行，头两个阶段的培养基必须含有一种植物生长素型的激素。然而，这项方法具有几种缺点，一方面是仅可应用于一个尺寸范围狭小(从0.1到2毫米)的胚胎，因而灵活性较差，另一方面需要在第一阶段和第二阶段之间调换培养基，总之所得胚胎的再生率还是很不够的。本专利技术涉及一项向日葵栽培品种的再生方法，比较简单，且可导致胚芽具有改善移栽入土的再生能力。更为特别地，本专利技术涉及一项从未成熟的胚胎出发进行向日葵栽培品种的再生方法，它包括以下几个阶段-从细胞或组织出发通过在一种含有激素的诱导培养基中的培养而使胚胎发生的胼胝体形成的第一阶段;-胚胎发生的胼胝体培养的第二阶段，以便其在一种含有激素的培养基中生长、发育和发芽;-可能还有一个第三阶段，包括使植株生长和发育的培养;其特征在于;头两个阶段是在同样性质的一种培养基中进行，且这种培养基含有一有效量的一种细胞激动素型的激素，而不含有植物生长激素。下述说明中，百分比以重量，体积表示之，明确规定的例外。植物组织(从中可为体细胞胚胎的生产提取活的植物组织)基本上来自在选择程序中所使用的向日葵的栽培品种Helicnthus connuus。举例说明是使用了以下8个栽培品种HA89、HA290 HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe(巨灰条纹)。品种HA89来自Dode Counts(达德地区)佛罗里达州，品种HA290、HA291、HA300、HA303、T76和RT26是来自国际种子技术公司(Seed tec.Internatianal Inc.，伍德兰，加利福尼亚州)，以及品种Gicnt Gray Slripe是来自北鲁帕金种子公司(Northyus King Seeds.弗雷斯诺，加利福民亚州)。活的植物组织是来自暖房栽培的植株，并经受受控授精。对于胼胝体的产生来说，优选的活植物组织是未成熟的胚胎。带果皮的未成熟胚胎是从向日葵的头状花序上分离的，当后者为4～21日龄时;其尺寸一般包括在0.1～5毫米之间。具有大尺寸的未成熟胚胎可按照通过微胚芽根轴的平面被切割成数个相等部份，这就从一个孤单胚胎出发获得倍增数量的无性繁植系。根据本专利技术的方法是按以下方式实行的向日葵品种HA89、HA290、HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe是在暖房内(26℃，40，000勒克司，光周期为每日15小时)栽培的，并经受受控授精。未成熟的胚胎在传粉后4～21天中采取。从头状花序中取下的种子是通过在添加有数滴润湿剂的3°Cl的市售次氯酸钠(或钾)消毒液中浸渍20分种来进行灭菌的，然后用无菌蒸馏水洗涤3次。接着，胚胎在无菌条件下进行分离，或许还要切割，以及置放在所述胚胎诱导的第一培养基上。第一培养基包括无机盐类、维生素类、氨基酸类、蔗糖和为胼胝体形成所需的足够量的一种激素。无机盐类包括常量元素的盐类和痕量元素的盐类。在此第一培养基中所使用的常量元素可在例如以下化合物中进行选择硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、硝酸钾和硝酸铵。痕量元素为基的盐类，我们可列举如硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、以及铁-Na-EDTA(乙二胺四乙酸)的螯合物。这种无机盐类的组合为众所周知的叫做穆拉希格和斯库格(MS)的培养基。对于1升培养基来说，常量元素和痕量元素的优选量如下-370毫克的硫酸镁七水合物，-440毫克的氯化钙二水合物，-170毫克的磷酸二氢钾二水合物，-1900毫克的硝酸钾，-1650毫克的硝酸铵，-6.2毫克的硼酸，-22.3毫克的硫酸锰四水合物，-8.6毫克的硫酸锌七水合物，-0.25毫克的钼酸钠二水合物，-0.025毫克的硫酸铜五水合物，-0.025毫克的氯化钴六水合物，-0.83毫克的碘化钾，-36.7毫克的铁-Na-EDTA螯合物。第一培养基还含有维生素类，诸如烟酸、硫胺素(维生素B)、吡哆醇(维生素B)、肌醇以及一种氨基酸，诸如丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸，以及较好地为甘氨酸。对于1升的培养基来说，维生素类和氨基酸类的优选量如下-0.5毫克的烟酸，-0.1毫克的硫胺素盐酸，-0.5毫克的吡哆醇盐酸，-100毫克的肌醇，-2毫克的甘氨酸。第一培养基同时可含有维生素类和氨基酸类的增补量;此增补量对于体细胞胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
从细胞或组织出发通过体细胞胚胎发生法使向日葵的栽培品种（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ—ａｎｎｕｕｓ）再生的方法相继地包括：—在一诱导培养基（它含有一种激素以使胚胎发生胼胝体和细胞胚胎的形成以及所述胚胎的生长）中向日葵组织的培养阶段；—包括一 项能使所述胚胎萌发及发育成可能具有根部的植株（在所谓胚芽生长培养基上）的培养的一个第二阶段。—可能还有一个在所谓生根培养基上使所述植株的根部生长或形成的第三阶段；其特征在于：头两个阶段是在一种同一性质的培养基上实行的，以及其特征在于 ：此培养基含有一种有效量的细胞激动素型激素。

【技术特征摘要】
FR 1986-10-30 86 152991.从细胞或组织出发通过体细胞胚胎发生法使向日葵的栽培品种(Helianthus annuus)再生的方法相继地包括-在一诱导培养基(它含有一种激素以使胚胎发生胼胝体和细胞胚胎的形成以及所述胚胎的生长)中向日葵组织的培养阶段；-包括一项能使所述胚胎萌发及发育成可能具有根部的植株(在所谓胚芽生长培养基上)的培养的一个第二阶段。-可能还有一个在所谓生根培养基上使所述植株的根部生长或形成的第三阶段；其特征在于头两个阶段是在一种同一性质的培养基上实行的，以及其特征在于此培养基含有一种有效量的细胞激动素型激素。2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述组织是未成熟的胚胎。3.根据权利要求1和2之一的方法，其特征在于激素是从包括激动素、6-苄氨基嘌呤、2-异戊基腺嘌呤和玉米素(N6-异戊烯腺嘌呤)的组中选择的。4.根据权利要求3的方法，其特征在于激素是6-苄氨基嘌呤，其浓度在第一和第二培养基中为0.1～8微摩尔。5.根据权利要求1～4之一的方法，其特征在于6-苄氨基嘌呤的浓度在第一培养基中为2.2～4.4微摩尔，以及在第二培养基中为0.44～4.4微摩尔。6.根据权利要求1～5之一的方法，其特征在于头两种培养基含有蔗糖，在第一培养基中其浓度为8～12%和在第二培养基中其浓度为2～4%。7.根据权利要求6的方法，其特征在于蔗糖的浓度在...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治弗雷西内，马蒂娜弗雷西内，
申请(专利权)人：罗纳普朗克农业化学公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]