【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及母乳低聚糖生产，具体涉及一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法。
技术介绍
1、母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，hmos）是母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪，是母乳中重要的功效因子，具有重要的生物学功能，在新生儿的生长发育中发挥着重要的作用。hmos包括多种寡糖结构和200多个不同的异构体，有超过100种hmos结构已得到证明。其中，2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-fl）在hmos中约占31%（摩尔分数），含量为0.06~3.93g/l，是人乳中相对丰度最高的寡糖。2’-fl具有多种功能活性，包括调节肠道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫调节及促进神经系统发育和修复等，是婴幼儿配方奶粉的理想配料。目前，2′-fl的合成方法包括化学合成、全细胞合成和酶法合成。全细胞合成2’-fl基于微生物自身的代谢机制合成gdp-岩藻糖和外源表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶，是目前工业上生产2’-fl的主要方法，但是全细胞合成法的反应产物需要经过复杂的纯化过程才能得到较高纯度的2’-fl。
2、酶法合成中，常利用α-1,2-岩藻糖基转移酶催化gdp-岩藻糖和乳糖发生基团置换，生成2’-fl和鸟苷二磷酸（gdp）。酶法合成2’-fl专一性较高，反应条件温和可控，产物达到最高浓度时间短，反应体系中成分相对简单、易于纯化。但现有的α-1,2-岩藻糖基转移酶活性不高，储存过程中易失活，导致酶法合成2’-fl的产率不高。
技
1、针对现有的α-1,2-岩藻糖基转移酶活性较弱，储存过程中易失活的技术问题，本专利技术提供一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法，包括：（1）取表达α-1,2-岩藻糖基转移酶的大肠埃希氏菌工程菌，经发酵培养制得发酵液；将发酵液进行离心，离心后得到发酵菌体和第一上清液；（2）将发酵菌体与柠檬酸钠缓冲液混合，然后进行均质破壁处理，释放出胞内酶，离心后得到第二上清液，将第一上清液和第二上清液混合，得到粗酶液；（3）将粗酶液经澄清过滤得到酶清液，加入nacl和mgso4，调节ph为7.2~7.6，制得高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液。
2、大肠埃希氏菌工程菌为大肠埃希氏菌（ escherichia coli）k-12 mg1655blbyzt6，大肠埃希氏菌k-12 mg1655 blbyzt6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.28317，保藏日期为2023年08月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3、进一步的，nacl的浓度为50~100mm，mgso4浓度为25~50mm。
4、进一步的，步骤（1）中，发酵培养包括将大肠埃希氏菌工程菌接种于种子培养基中，在37℃下培养12~16h，制得种子液；将种子液接种于发酵培养基中，在33~35℃下发酵培养，发酵过程中不断补加发酵培养基，发酵48~56h。
5、进一步的，种子培养基包括如下浓度的组分：复配蛋白胨8~14g/l、酵母粉4~12g/l、氯化钠8~12g/l；复配蛋白胨包括重量比为2~3:1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨。
6、进一步的，发酵培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖5~40g/l、乳糖5~40g/l、复配蛋白胨10~15g/l、酵母粉20~30g/l、磷酸氢二钾10~20g/l、磷酸二氢钾1~5g/l、微量金属元素溶液5~15ml/l；微量金属元素溶液包括如下浓度的成分：硫酸亚铁6g/l、一水硫酸锰0.35g/l、七水硫酸锌2.22g/l、无水硫酸铜1.0g/l、钼酸铵0.11g/l。
7、进一步的，步骤（2）中，发酵菌体与柠檬酸钠缓冲液的混合体积比为1:10。
8、进一步的，步骤（2）中，均质破壁处理的运行温度为8~10℃，运行压力为90~100mpa。
9、进一步的，步骤（3）中，澄清过滤使用0.2~0.45μm针式过滤器。
10、本专利技术的有益效果在于：
11、1、本专利技术提供的一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法，通过对大肠埃希氏菌k-12 mg1655 blbyzt6发酵液中的发酵菌体均质，释放胞内酶，再与原发酵液的上清液混合，并加入nacl和mgso4，可以明显提高α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的酶活力。
12、2、本专利技术提供的一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法，制得的α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液在3℃下保存20天，酶活力仍能保留70%左右，可以显著减少酶液酶活力的损失，延长酶液的酶活保质期，有助于提高酶法合成2’-fl的产率。
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1.一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法，其特征在于，包括：（1）取表达α-1,2-岩藻糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，经发酵培养制得发酵液；将发酵液进行离心，离心后得到发酵菌体和第一上清液；（2）将发酵菌体与柠檬酸钠缓冲液混合，然后进行均质破壁处理，释放出胞内酶，离心后得到第二上清液，将第一上清液和第二上清液混合，得到粗酶液；（3）将粗酶液经澄清过滤得到酶清液，加入NaCl和MgSO4，调节pH为7.2~7.6，制得高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，NaCl的浓度为50~100mM，MgSO4浓度为25~50mM。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵培养包括将大肠杆菌工程菌接种于种子培养基中，在37℃下培养12~16h，制得种子液；将种子液接种于发酵培养基中，在33~35℃下发酵培养，发酵过程中不断补加发酵培养基，发酵48~56h。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，种子培养基包括如下浓度的组分：复配蛋白胨8~14g/L、酵母粉4~12g/L、氯化钠8~12g
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖5~40g/L、乳糖5~40g/L、复配蛋白胨10~15g/L、酵母粉20~30g/L、磷酸氢二钾10~20g/L、磷酸二氢钾1~5g/L、微量金属元素溶液5~15mL/L。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，微量金属元素溶液包括如下浓度的成分：硫酸亚铁6g/L、一水硫酸锰0.35g/L、七水硫酸锌2.22g/L、无水硫酸铜1.0g/L、钼酸铵0.11g/L。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵菌体与柠檬酸钠缓冲液的混合体积比为1:10。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，均质破壁处理的运行温度为8~10℃，运行压力为90~100Mpa。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，澄清过滤使用0.2~0.45μm针式过滤器。
...【技术特征摘要】
1.一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法，其特征在于，包括：（1）取表达α-1,2-岩藻糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，经发酵培养制得发酵液；将发酵液进行离心，离心后得到发酵菌体和第一上清液；（2）将发酵菌体与柠檬酸钠缓冲液混合，然后进行均质破壁处理，释放出胞内酶，离心后得到第二上清液，将第一上清液和第二上清液混合，得到粗酶液；（3）将粗酶液经澄清过滤得到酶清液，加入nacl和mgso4，调节ph为7.2~7.6，制得高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，nacl的浓度为50~100mm，mgso4浓度为25~50mm。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵培养包括将大肠杆菌工程菌接种于种子培养基中，在37℃下培养12~16h，制得种子液；将种子液接种于发酵培养基中，在33~35℃下发酵培养，发酵过程中不断补加发酵培养基，发酵48~56h。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，种子培养基包括如下浓度的组分：复配...
【专利技术属性】
技术研发人员：李培功，王红霞，曹梦思，尹佳琪，刘超，赵嫚，
申请(专利权)人：保龄宝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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