【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法。
技术介绍
1、随着养殖业和农产品加工业向大型化发展以及沼气作为新能源开发利用，我国沼气工程正朝着大型化、产业化方向发展。但在实际的沼气工程中，由于来源物质组成的复杂性以及工程操作条件的实际影响，沼气、沼液往往无法达到预期的净化效果。微藻-真菌共生体较单一微藻在沼液沼气净化体系中具有明显优势，回收成本低，应用前景良好。但藻菌生长同步性差、藻菌球形成困难、均匀性低、耗时较长等问题一直制约着该技术的发展与推广。某些微藻在特定培养条件下可以分泌独脚金内酯及其类似物(sls)，促进真菌菌丝分支，加快藻菌球的形成。
2、独脚金内酯是独脚金醇类化合物及其衍生物的总称，其发现源于对独脚金种子萌发的刺激，因此命名为独脚金内酯。天然独脚金内酯主要包括独脚金醇、列当醇及其衍生物、高粱内酯等。人工合成的独脚金内酯主要是独脚金醇类似物(germination releaser，gr)，其中gr24活性最高，常被用作独脚金内酯信号通路相关的研究中的常规阳性参照物。独脚金内酯是一种新型植物激素，能作为信号分子抑制植物侧芽伸长，促进共生菌丝分支，进而影响植株形态与共生菌群构成。
3、然而目前，独脚金内酯在藻菌共生体系间的转导和净化体系中的作用机制尚不明确。因此专利技术一种藻菌共生体联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，可以有效提高藻菌共生体对沼液的净化效率，具有较大的实际应用价值。
技术实现思路
1、本专利技
2、为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，包括以下步骤：
4、s1：小球藻的培养：将小球藻(fachb-8)利用bg-11培养基对小球藻进行扩培，扩培光照由冷白色led灯提供，光照强度为200μmol m-2s-1，光暗比为12h:12h，扩培温度控制在25±2℃，扩培时间为7天；
5、s2：小球藻内生菌的培养：将10ml小球藻培养液无菌转移至50ml无菌管中，离心并弃去上清液，用无菌水离心反复洗涤沉淀物；将得到的海藻泥与0.5ml无菌水混合，转移到10ml无菌玻璃研磨管中，在无菌手术台上研磨20分钟；接着，将100μl稀释液倒入lb固体培养基中，在37±1℃无光条件下培养，当600nm的光学值约为0.95时，培养结束；根据生长标准曲线，菌液约为2.0×107cells/ml，得到内生细菌s395-2；
6、s3：小球藻-小球藻内生菌的共培养：将步骤s1得到的小球藻与步骤s2得到的内生细菌s395-2，以初始生物量比为1:10，既小球藻2.0×106cell/ml:内生细菌2.0×107cell/ml，在温度25±1℃、光照强度200μmol·m-2·s-1、转速160rpm、光暗比12h光照/12h黑暗进行培养；
7、s4：将上述得到的小球藻-小球藻内生菌共生体转移到沼液中，所述沼液中加入不同浓度的独脚金内酯(gr24)，然后将沼液置于一定条件下处理，得到处理后的沼液。
8、优选的，步骤s1中，bg-11培养基的组成为：nano31.5 g l-1、k2hpo4·3h2o 0.04gl-1、kh2po4·3h2o 0.2g l-1、乙二胺四乙酸0.5mg l-1、柠檬酸铁铵5mg l-1、柠檬酸5mgl-1、na2co30.025mg l-1和微量金属溶液1ml l-1。
9、优选的，步骤s2中离心时，转速为8000r/min，离心时间为10min。
10、优选的，步骤s2中，lb固体培养基包括：色氨酸:10g/l、酵母浸膏:5g/l、氯化钠:10g/l和琼脂粉:15g/l，ph:7.0-7.2。
11、优选的，步骤s2小球藻内生菌的制备，小球藻内生菌s395-2与小球藻存在明显的互作效应，在一定限度内，小球藻内生菌浓度越高，促生长效果越明显；浓度较低时，有个别出现生长速率降低，但都在误差范围内，无明显抑制作用。
12、优选的，步骤s4藻菌共生体转移到沼液中，所述沼液中独脚金内酯gr24的添加浓度为10-9m和10-11m，然后将沼液置于一定条件下处理。
13、优选的，沼液处理条件为：温度为25℃，光照强度为200μmol·m-2·s-1、光暗时间比为12h光照/12h黑暗；处理时间为10天。
14、本专利技术的有益效果是：
15、1、利用藻菌共生体系联合独脚金内酯对沼液中的抗生素抗性基因具有较好的削减效果，具有大规模推广应用的潜力。
16、2、实现了不同独脚金内酯类似物gr24浓度下，藻菌共生体对沼液中抗生素抗性基因去除效果的应用。
17、3、本方法的构建能够实现沼液净化体系的最优化。
18、4、对沼液中磺胺类抗生素抗性基因(sul1、sul2)、四环素类抗生素抗性基因(tetx、tetw)等args具有良好的去除效果的。
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1.一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤S1中，BG-11培养基的组成为：NaNO31.5 g L-1、K2HPO4·3H2O0.04g L-1、KH2PO4·3H2O 0.2g L-1、乙二胺四乙酸0.5mg L-1、柠檬酸铁铵5mg L-1、柠檬酸5mg L-1、Na2CO30.025 mg L-1和微量金属溶液1mL L-1。
3.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤S2中离心时，转速为8000r/min，离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤S2中，LB固体培养基包括：色氨酸:10g/L、酵母浸膏:5g/L、氯化钠:10g/L和琼脂粉:15g/L，pH:7.0-7.2。
5.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性
6.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤S4藻菌共生体转移到沼液中，所述沼液中独脚金内酯GR24的添加浓度为10-9M和10-11M，然后将沼液置于一定条件下处理。
7.根据权利要求6所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：沼液处理条件为：温度为25℃，光照强度为200μmol·m-2·s-1、光暗时间比为12h光照/12h黑暗；处理时间为10天。
...【技术特征摘要】
1.一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤s1中，bg-11培养基的组成为：nano31.5 g l-1、k2hpo4·3h2o0.04g l-1、kh2po4·3h2o 0.2g l-1、乙二胺四乙酸0.5mg l-1、柠檬酸铁铵5mg l-1、柠檬酸5mg l-1、na2co30.025 mg l-1和微量金属溶液1ml l-1。
3.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤s2中离心时，转速为8000r/min，离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的一种藻菌共生联合独脚金内酯削减沼液中抗生素抗性基因的方法，其特征在于：步骤s2中，lb固体培养基包括：色氨酸:10g/l、酵母浸膏:5g/l...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦静，应伟，张浩，唐余斌，雷朝亮，李慧慧，陈朵朵，
申请(专利权)人：嘉兴南湖学院，
类型：发明
国别省市：
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