【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna、慢病毒及构建方法和应用。
技术介绍
1、中国大鲵(andrias davidianus)是我国特有的二级保护动物，在脊椎动物免疫系统的进化史中具有水生向陆生过渡的进化特征和生理学特点，因此在研究物种起源、进化和免疫系统分子生物学等方面具有重要的研究价值。
2、mhc分子是一类重要的组织相容性复合物，通过递呈抗原至cd8+t细胞，启动适应性免疫。最近的研究发现，mhc分子还能以受体的形式参与调控细胞的生长、增殖、激活及凋亡等过程。研究人员发现，敲除mhc-ⅱ的小鼠，tlrs诱导的巨噬细胞及dcs分泌的促炎因子及ⅰ型ifn表达明显下降，而胞内mhc-ⅱ也能募集并激活lck，进而激活plcγ1及下游ca2+/camkii通路，共同促进tlrs通路的激活，也就是说，在机体中，mhc-ⅱ类分子可能是调节tlrs激活固有免疫应答的关键因子。
3、慢病毒载体(lentiviral vectors,lvs)是一种基于人类免疫缺损病毒(hiv-1病毒)的病毒载体，已去除毒性基因，分成三种或四种不同的质粒，分别为转移质粒(transferplasmid)、包装质粒(packaging plasmid)与外膜蛋白质粒(envelop plasmid)，大大提高了安全性，具有了将靶基因(或rna干扰)有效引入到动物及人类原代细胞或细胞系中的能力，既能转染分裂细胞，又能转染不分裂细胞。当一个病毒的基因组反转录为dna并将其永久性地嵌入到细胞基因组时，其所产
4、目前已有的大鲵基因干扰沉默方法多是利用sirna进行转染，使之进入细胞，发挥使靶基因沉默的效应，该方法受转染效率的影响较大，质粒载体转染效率低。
5、并且mhc-ii分子是一类重要的免疫功能基因，参与了巨噬细胞抗原呈递功能，对该基因的研究多是在小鼠等哺乳动物中，大鲵作为水生动物和陆生动物的过度生物——两栖类动物，该分子除了抗原呈递功能是否还有其他功能目前并不明晰。
技术实现思路
1、为挖掘mhc-ii分子在两栖类动物中的应用，本专利技术提供了一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna、慢病毒及构建方法和应用，本专利技术提供的psc-2shrna和psc-3shrna均可以显著敲低mhc-ii-α蛋白的表达，且敲低效率高于50％；psc-4、psc-5以及psc-6均可以显著敲低mhc-ii-β蛋白的表达，其中psc-4和psc-6具有良好的敲低效果，且psc-4的敲低效率高于50％。
2、本专利技术提供了一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna，包括抑制mhc-ⅱ-α的shrna和抑制mhc-ⅱ-β基因的shrna；
3、所述抑制mhc-ⅱ-α的shrna的靶序列为psc-1、psc-2和psc-3中的任意一条；
4、所述psc-1的核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、所述psc-1shrna的正义寡核苷酸如seq id no.8所示，所述psc-1shrna的反义寡核苷酸如seq id no.9所示；
6、所述psc-2的核苷酸序列如seq id no.3所示；
7、所述psc-2shrna的正义寡核苷酸如seq id no.10所示，所述psc-2shrna的反义寡核苷酸如seq id no.11所示；
8、所述psc-3的核苷酸序列如seq id no.4所示；
9、所述psc-3shrna的正义寡核苷酸如seq id no.12所示，所述psc-3shrna的反义寡核苷酸如seq id no.13所示；
10、所述抑制mhc-ⅱ-β基因的shrna的靶序列为psc-4、psc-5和psc-6中的任意一条；
11、所述psc-4的核苷酸序列如seq id no.5所示；
12、所述psc-4shrna的正义寡核苷酸如seq id no.14所示，所述psc-4shrna的反义寡核苷酸如seq id no.15所示；
13、所述psc-5的核苷酸序列如seq id no.6所示；
14、所述psc-5shrna的正义寡核苷酸如seq id no.16所示，所述psc-5shrna的反义寡核苷酸如seq id no.17所示；
15、所述psc-6的核苷酸序列如seq id no.7所示。
16、所述psc-6shrna的正义寡核苷酸如seq id no.18所示，所述psc-6shrna的反义寡核苷酸如seq id no.19所示。
17、本专利技术还提供了一种用于抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna表达载体，所述shrna表达载体包括上述shrna。
18、本专利技术还提供了一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna表达载体的构建方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的shrna插入载体中获得shrna表达载体。
19、进一步地，所述载体为plko.1-trc质粒。
20、进一步地，构建所得的shrna表达载体包括mhc-ⅱ-α-shrna和mhc-ⅱ-β-shrna慢病毒表达载体。
21、本专利技术还提供了一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的重组慢病毒，所述重组慢病毒采用所述的shrna表达载体与包装质粒共转染哺乳动物细胞系制备得到。
22、本专利技术还提供了一种大鲵mhc-ⅱ基因的抑制剂，所述抑制剂为所述的shrna、所述的表达载体和所述的重组慢病毒任意一种或两种的组合。
23、本专利技术还提供了所述的shrna、所述的表达载体或所述的重组慢病毒在制备抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的试剂中的应用。
24、本专利技术还提供了所述的shrna、所述的表达载体或所述的重组慢病毒在构建免疫缺陷型动物模型中的应用。
25、进一步地，所述动物模型为大鲵免疫缺陷模型。
26、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
27、相比而言，构建shrna的慢病毒表达载体，利用慢病毒进行细胞感染，解决了质粒载体转染效率低的缺陷。
28、1、本专利技术提供了一种抑制大鲵mhc-ⅱ-α和mhc-ⅱ-β基因表达的shrna慢病毒，所述慢病毒中克隆有针对大鲵mhc-ⅱ-α和mhc-ⅱ-β基因设计的shrna，包括psc-1shrna、psc-2shrna、psc-3shrna、psc-4shrna、psc-5shrna和psc-6shrna；正、反义寡核苷酸依次分别如seq id no.8-9，seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制大鲵MHC-Ⅱ基因表达的shRNA，其特征在于，包括抑制MHC-Ⅱ-α的shRNA和抑制MHC-Ⅱ-β基因的shRNA；
2.一种用于抑制大鲵MHC-Ⅱ基因表达的shRNA表达载体，其特征在于，所述shRNA表达载体包括如权利要求1所述的shRNA。
3.一种权利要求2所述的shRNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的shRNA插入载体中获得shRNA表达载体。
4.根据权利要求3所述的shRNA表达载体的构建方法，其特征在于，所述载体为pLKO.1-TRC质粒。
5.根据权利要求3所述的shRNA表达载体的构建方法，其特征在于，构建所得的shRNA表达载体包括MHC-Ⅱ-α-shRNA和MHC-Ⅱ-β-shRNA慢病毒表达载体。
6.一种抑制大鲵MHC-Ⅱ基因表达的重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用如权利要求2所述的shRNA表达载体与包装质粒共转染哺乳动物细胞系制备得到。
7.一种大鲵MHC-Ⅱ基因的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为权利要求1所述的shRN
8.一种权利要求1所述的shRNA、权利要求2所述的表达载体或权利要求6所述的重组慢病毒在制备抑制大鲵MHC-Ⅱ基因表达的试剂中的应用。
9.一种权利要求1所述的shRNA、权利要求2所述的表达载体或权利要求6所述的重组慢病毒在构建免疫缺陷型动物模型中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动物模型为大鲵免疫缺陷模型。
...【技术特征摘要】
1.一种抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna，其特征在于，包括抑制mhc-ⅱ-α的shrna和抑制mhc-ⅱ-β基因的shrna；
2.一种用于抑制大鲵mhc-ⅱ基因表达的shrna表达载体，其特征在于，所述shrna表达载体包括如权利要求1所述的shrna。
3.一种权利要求2所述的shrna表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的shrna插入载体中获得shrna表达载体。
4.根据权利要求3所述的shrna表达载体的构建方法，其特征在于，所述载体为plko.1-trc质粒。
5.根据权利要求3所述的shrna表达载体的构建方法，其特征在于，构建所得的shrna表达载体包括mhc-ⅱ-α-shrna和mhc-ⅱ-β-shrna慢病毒表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓捷，韩梦迪，方程，赵虎，张晗，张建禄，王启军，孔飞，姜维，马红英，张红星，
申请(专利权)人：陕西省动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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