【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备高活性固定化乙酰胆碱酯酶（ache）的方法，尤其涉及一种利用zif-8原位固定和柠檬酸（ca）刻蚀策略制备高活性固定化乙酰胆碱酯酶的方法，主要用于ache抑制剂的筛选，属于药物分析化学。
技术介绍
1、乙酰胆碱酯酶（ache）是与阿尔茨海默病（ad）相关的最重要的靶酶之一，抑制其活性可提高乙酰胆碱水平，恢复胆碱能神经传递过程，有助于治疗与ad相关的认知行为。然而，已投入临床使用的石杉碱甲等抑制剂具有一定的毒副作用，长期疗效不佳。因此，筛选潜在的ache抑制剂在新药开发领域具有重要意义。
2、天然酶在实际应用中易受到化学环境、温度、缓冲体系等外界因素的影响，导致其催化活性和稳定性降低，难以被纯化回收利用，大大增加了药物筛选的成本。为了提高酶结构稳定性并保持催化活性，基于酶与载体相互作用的酶固定化策略应运而生。近年来，mofs因其孔径可调、比表面积大、结构简单、环境稳定等有意的理化性质在固定酶化领域备受关注。目前，已有大量研究以mofs为载体，通过共价、交联、吸附、包埋等方法构建了酶-mofs复合材料，成功提高了固定化酶的稳定性和可重复使用性。值得注意的是，mofs的三维隔间存在官能团的定向排列，其孔径通常小于2 nm，这导致固定在mofs内部的酶的最优构象占比和底物可及性因微环境限制和传质阻力降低，无法完全发挥酶活力。
3、众所周知，提高酶结构稳定性并保持其催化活性是提高酶利用率和降低药物筛选成本的有效方法。然而，在现有的固定化技术中，由于构象变化和微环境的限制，固定化酶的活性往往会下
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种通过zif-8原位固定和柠檬酸刻蚀策略制备高活性固定化乙酰胆碱酯酶的方法。
2、一、高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备
3、将ache（乙酰胆碱酯酶）溶液、乙酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液依次加入离心管，在0~25℃下搅拌（200~500rpm）反应30~60分钟后离心（10000~12000 rpm，3~10分钟）分离沉淀；将沉淀分散在ca（柠檬酸）溶液中孵育处理后离心，收集离心产物，用去离子水洗涤三次以去除残留的ca，即得高活性固定化乙酰胆碱酯酶ache@zif-8-ca。
4、ache购自索莱宝科技有限公司，规格为220 u/g，ache溶液的浓度为1 u/ml；乙酸锌溶液浓度为0.2~0.4m，2-甲基咪唑溶液浓度为1~1.5m，且ache溶液、乙酸锌溶液、2-甲基咪唑溶液的体积比为1:1:10。
5、ca溶液浓度为0.01~10 mm，沉淀在ca溶液中孵育处理的温度为4~37℃，孵育时间为1~9分钟。
6、二、ache@zif-8-ca的催化活性研究
7、下面对固定化酶活力的测定、刻蚀条件的优化、固定化酶的稳定性的评估、酶抑制作用研究以及从 z. bungeanum根部分离得到的化合物中筛选抑制剂的实验步骤作进一步详细说明。
8、1、测定固定化酶催化活性及柠檬酸刻蚀条件的优化
9、通过ellman方法在405 nm处检测产物2-硝基-5-硫苯甲酸（tnb）吸光度的变化以评估酶活性和固定化酶稳定性。在ellman方法中，底物atchi被ache水解为硫代胆碱（tch），tch进一步与dtnb反应，生成可通过比色法检测的黄色化合物2-硝基-5-硫苯甲酸（tnb）。具体测定方法如下：
10、将固定化ache加入到磷酸盐缓冲液中，在37℃下孵育5分钟后，立即加入atchi溶液（0.5~5 mm）和dtnb溶液（0.4~1 mm）激活催化反应。反应15分钟后，离心（10000~12000rpm，3~10分钟）分离上清液，将其转移至96孔板中。最后，通过rt-6100酶标仪在405 nm下测量黄色产物tnb的吸光度。对于游离ache的活性测定，用相等量ache溶液（稀释12倍）代替固定化ache。其他步骤保持不变。
11、上述固定化ache、磷酸盐缓冲液、显色剂dtnb溶液、底物atchi溶液的体积比为2:2:8:5。
12、为了研究游离和固定化酶的催化动力学，根据michaelis-menten方程确定动力学常数（ k m和 v max），如公式（1）：
13、
14、其中 v和 v max分别是初始和最大的反应速率， k m是米氏常数，[ s]是初始底物atchi的浓度。图1为酶-mof生物复合材料的酶活性评估。图1a为ca浓度对固定化ache活性的影响；图1b为刻蚀时间对固定化ache活性的影响；图1c为最佳条件下游离ache、ache@zif-8和ache@zif-8-ca的相对催化活性；图1d为游离ache、ache@zif-8和ache@zif-8-ca的酶促反应动力学曲线。由图1a和1b可知，ache@zif-8-ca的相对催化活性在一定范围内随着柠檬酸浓度和刻蚀时间的增加而提高，在柠檬酸浓度为1 mm和刻蚀时间为2分钟时达到最大，之后随着柠檬酸浓度的增加和刻蚀时间的延长，ache@zif-8-ca活性出现降低。故选择1 mm柠檬酸和刻蚀2分钟作为最佳刻蚀条件。在最佳刻蚀条件下，ache@zif-8-ca的酶活性相对游离酶增强了6.10倍（如图1c所示）。此外，ache@zif-8因传质受限降低了酶与底物的亲和力，导致ache@zif-8的 k m（8.42 mm）高于游离酶，而在1 mm ca下刻蚀2分钟后，ache@zif-8-ca的 k m（5.61 mm）显著降低，其催化效率（11.33×10-3min-1）提高到前者（5.82×10-3min-1）的1.95倍，是游离酶的1.20倍（如图1d和表1所示）。这证实ca刻蚀复合材料有利于酶活性位点的暴露，同时促进了分子扩散，从而显著增强了固定化ache活性。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，是将AChE溶液、乙酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液依次加入离心管，在0~25℃下搅拌反应30~60分钟后离心分离沉淀；将沉淀分散在CA溶液中孵育处理后离心，收集离心产物，用去离子水洗涤三次以去除残留的CA，即得高活性固定化乙酰胆碱酯酶AChE@ZIF-8-CA。
2.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：AChE购自索莱宝科技有限公司，规格为220 U/g，AChE溶液的浓度为1 U/mL，乙酸锌溶液浓度为0.2~0.4M，2-甲基咪唑溶液浓度为1~1.5M，且AChE溶液、乙酸锌溶液、2-甲基咪唑溶液的体积比为1:1:10。
3.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：所述搅拌反应的速度为200~500rpm。
4.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：所述离心分离沉淀的转速为10000~12000 rpm，时间为3~10分钟。
5.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：所述
6.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：所述沉淀在CA溶液中孵育处理的温度为4~37℃，孵育时间为1~9分钟。
7.如权利要求1所述方法制备的高活性固定化乙酰胆碱酯酶在筛选AChE抑制剂中的应用。
8.如权利要求7所述高活性固定化乙酰胆碱酯酶在筛选AChE抑制剂中的应用，其特征在于：从Zanthoxylum bungeanumMaxim根部化合物中筛选AChE抑制剂。
...【技术特征摘要】
1.一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，是将ache溶液、乙酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液依次加入离心管，在0~25℃下搅拌反应30~60分钟后离心分离沉淀；将沉淀分散在ca溶液中孵育处理后离心，收集离心产物，用去离子水洗涤三次以去除残留的ca，即得高活性固定化乙酰胆碱酯酶ache@zif-8-ca。
2.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：ache购自索莱宝科技有限公司，规格为220 u/g，ache溶液的浓度为1 u/ml，乙酸锌溶液浓度为0.2~0.4m，2-甲基咪唑溶液浓度为1~1.5m，且ache溶液、乙酸锌溶液、2-甲基咪唑溶液的体积比为1:1:10。
3.如权利要求1所述一种高活性固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于：所述搅拌反应的速度为200~500r...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨军丽，常香蕾，王伟峰，
申请(专利权)人：中国科学院兰州化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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