【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于移植排斥治疗领域，具体涉及靶向allo-b细胞的hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
1、器官移植是治疗终末期器官衰竭的有效手段，但器官移植后会出现很多并发症，而抗体介导的排斥反应(antibody mediated rejection，amr)是器官移植后的一种重要并发症，由抗供体特异性抗体(anti-donor specific antibodies，dsa)损伤引起，以高度多态性的经典hla分子抗体为主。amr发生在所有移植的实体器官和组织中，其发生率从3％到30％不等，取决于移植后的时间和组织类型。在缺乏有效措施的干预时，dsa介导的对移植物的排斥反应会极大地缩短移植物在受者体内的存活时间，最终导致移植失败。当前临床治疗和预防措施有使用抗cd20单克隆抗体清除所有的b淋巴细胞，使用血浆置换或蛋白a免疫吸附清除所有的igg，特异性均不高。
2、hla分子广泛表达于所有的有核细胞表面。由于个体间hla抗原的遗传变异很大，供受者之间的hla不能完全匹配，hla的错配会导致受者产生针对供者器官上的hla分子的抗hla抗体。allo-反应性b细胞(allo-b细胞)是人体针对同种异体抗原发生免疫反应的一类b细胞，其产生的抗体称为抗同种异型抗体，如抗hla-ⅰ类和ⅱ类抗体。抗hla抗体由受者体内的特异性的allo-b淋巴细胞产生，此特异性的allo-b淋巴细胞表面的bcr与抗hla抗体的胞外段是一致的，是识别和靶向清除allo-b细胞的靶标分子。hla分子可与allo-b淋巴细胞表面
3、因此，在这里针对hla-ⅰ类分子的高频率抗原hla-a*24:02(记为a24)和hla-b*13:02(记为b13)(分别占供者人群中的29％和18.7％)，开发了两种hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，分别是a24-fc和b13-fc。该融合蛋白可以靶向特异性的allo-b淋巴细胞，通过fc与nk细胞表面的fc受体结合介导nk细胞杀伤产生抗hla抗体的allo-b淋巴细胞。这些发现为选择性体液免疫反应脱敏提供了一种新的策略，从而预防器官移植排斥反应。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于构建一种hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，
2、本专利技术的另一目的在于提供上述hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白在杀伤分泌抗hla抗体的allo-b淋巴细胞中的应用。
3、在一些实施方式中，所述hla-ⅰ类分子包含如下氨基酸序列，基本由以下氨基酸序列组成，以下实施例以hla-ⅰ类分子常见的两种类型(hla-a*24:02，hla-b*13:02)举例，应当理解，所有hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的构建均应该包括在本专利中。
4、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
5、一种hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，从氨基端至羧基端由hla-ⅰ类分子的胞外结构域和人igg1的fc段两部分组成。hla-ⅰ类分子胞外结构域用于结合allo-b淋巴细胞表面的bcr。人igg1的fc段，作用在于免疫调理和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，包括：kozak序列和信号肽、柔性连接子1、β2微球蛋白、柔性连接子2、hla-ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)、柔性连接子1和人i gg1的fc。kozak序列和信号肽有助于蛋白的胞外表达，且信号肽在蛋白成熟时会被切割掉。柔性连接子1和柔性连接子2用于连接作用。β2微球蛋白和hla-ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)用于构成融合蛋白的hla-ⅰ类分子部分。人i gg1的fc用于构成融合蛋白的fc部分。
6、hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的氨基酸序列由依次排列的以下组分组成：kozak序列和信号肽氨基酸序列、柔性连接子1氨基酸序列、β2微球蛋白氨基酸序列、柔性连接子2氨基酸序列、hla-ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)氨基酸序列、柔性连接子1氨基酸序列和人i gg1的fc氨基酸序列。
7、hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的氨基酸序列，包括如下部分：
8、所述的kozak序列和信号肽氨基酸序列，如seq id no.1所示；
9、所述的柔性连接子1氨基酸序列，如seq id no.2所示；
10、所述的β2微球蛋白氨基酸序列，如seq id no.3所示；
11、所述的柔性连接子2氨基酸序列，如seq id no.4所示；
12、所述的hla-ⅰ类分子hla-a*24:02胞外结构域(α1-α3)氨基酸序列，
13、如seq id no.5所示；
14、所述的hla-ⅰ类分子hla-b*13:02胞外结构域(α1-α3)氨基酸序列，
15、如seq id no.6所示；
16、所述的人i gg1的fc氨基酸序列，如seq id no.7所示。
17、hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的核苷酸序列，包括如下部分：
18、所述的kozak序列和信号肽核苷酸序列，如seq id no.8所示；
19、所述的柔性连接子1核苷酸序列，如seq id no.9所示；
20、所述的β2微球蛋白核苷酸序列，如seq id no.10所示；
21、所述的柔性连接子2核苷酸序列，如seq id no.11所示；
22、所述的hla-ⅰ类分子hla-a*24:02胞外结构域(α1-α3)核苷酸序列，
23、如seq id no.12所示；
24、所述的hla-ⅰ类分子hla-b*13:02胞外结构域(α1-α3)核苷酸序列如seq id no.13所示；
25、所述的人igg1的fc核苷酸序列，如seq id no.14所示。
26、上述hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：应当理解，以下以hla-ⅰ类分子常见的两种类型(hla-a*24:02，hla-b*13:02)举例，所有hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的构建均应该包括在本专利中。
27、(1)融合质粒构建：构建a24-fc和b13-fc融合蛋白表达载体，其核苷酸序列为：kozak序列、信号肽、柔性连接子1、β2微球蛋白、柔性连接子2、hla-ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)、柔性连接子1和人igg1的fc。
28、(2)融合蛋白的表达：将构建好的hla-ⅰ类分子-fc融合质粒转染悬浮hek293细胞，收集上清，获得蛋白；
29、(3)融合蛋白的纯化：将(2)中收集的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白，其特征在于：所述HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白，包括：Kozak序列和信号肽、柔性连接子1、β2微球蛋白、柔性连接子2、HLA I类分子胞外结构域(α1-α3)、柔性连接子1和人IgG1的Fc。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：Kozak序列和信号肽有助于蛋白的胞外表达，且信号肽在蛋白成熟时会被切割掉；柔性连接子1和柔性连接子2用于连接作用；β2微球蛋白和HLA-Ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)用于构成融合蛋白的HLA-Ⅰ类分子部分；人IgG1的Fc用于构成融合蛋白的Fc部分。
3.根据权利要求1所述的HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白，其特征在于：所述的HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白的氨基酸序列由依次排列的以下组分组成：Kozak序列和信号肽氨基酸序列、柔性连接子1氨基酸序列、β2微球蛋白氨基酸序列、柔性连接子2氨基酸序列、HLA-Ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)氨基酸序列、柔性连接子1氨基酸序列和人IgG1的Fc氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白的氨基酸序列
5.根据权利要求1所述的HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：
6.根据权利要求1-5任一所述的HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：
7.权利要求1-5任一项所述HLA-Ⅰ类分子-Fc融合蛋白在杀伤分泌抗HLA-Ⅰ类分子抗体的allo-B淋巴细胞中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，其特征在于：所述hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，包括：kozak序列和信号肽、柔性连接子1、β2微球蛋白、柔性连接子2、hla i类分子胞外结构域(α1-α3)、柔性连接子1和人igg1的fc。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：kozak序列和信号肽有助于蛋白的胞外表达，且信号肽在蛋白成熟时会被切割掉；柔性连接子1和柔性连接子2用于连接作用；β2微球蛋白和hla-ⅰ类分子胞外结构域(α1-α3)用于构成融合蛋白的hla-ⅰ类分子部分；人igg1的fc用于构成融合蛋白的fc部分。
3.根据权利要求1所述的hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白，其特征在于：所述的hla-ⅰ类分子-fc融合蛋白的氨基酸序...
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