【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子分析，具体涉及一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法。
技术介绍
1、蛋白糖基化与疾病发生发展紧密相关，解析与疾病相关的糖基化为疾病早期筛查和治疗提供了靶点。对单一n糖基化，可以通过氧化聚糖并与酰肼共价结合，再通过糖苷酶酶切可分析蛋白n糖基化位点；通过亲水结合富集(hilic)，可分析完整n-糖肽；通过固相化学酶及o糖蛋白酶，可以分析部分o-糖基化位点。然而这些方法不能对同一蛋白多种糖基化的分析，即很多糖蛋白同时具有n糖基化和o糖基化，但是在同一蛋白上同时实现对多种糖基化的分析技术尚未出现，因此需要一种新型技术，可全方位解析n和o糖基化。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，以解决现有技术中不能实现在同一蛋白上同时对多种糖基化分析的难题。
2、本专利技术的一种技术方案是：
3、一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，包括步骤：
4、(1)通过胰蛋白酶酶解糖蛋白形成糖肽和多肽；
5、(2)利用固相氨基苯并硼酸衍生物介质特异性富集样本中的糖肽，得到已连接上糖肽的固相介质；
6、(3)利用n-糖苷酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行n-糖基化分析，并定量检测n-糖蛋白；
7、(4)使用galnacexo酶来切割所述已连接上糖肽的固相
8、(5)利用o-glycosidase酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行切割分析，从而得到t抗原o-糖肽；
9、(6)使用operator富集具有无唾液酸修饰的复杂o-聚糖糖肽；
10、(7)使用impa富集唾液酸化复杂o-糖肽。
11、进一步的，在步骤(1)中，所述通过胰蛋白酶酶解糖蛋白形成糖肽和多肽具体为：将含有糖蛋白的样本在15,000×g离心10-15分钟，取1-2微升上清液测试蛋白浓度，根据测试蛋白浓度的结果取500-1000微克蛋白质，加入5-10微克胰蛋白酶，调节ph 7.4-8.0，37℃酶解16-18小时，得到含有肽段和盐的复杂溶液样本，将所述复杂溶液样本溶解在体积百分比为0.1％的三氟乙酸的hplc水溶液中，控制总体积为1-2毫升，得到初级样本，所述初级样本用c18萃取柱除盐，获得含有糖肽和多肽的样本。
12、进一步的，所述初级样本用c18萃取柱除盐之前，先将c18萃取柱用900-1000微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液洗涤萃取柱两次，再用900-1000毫升体积百分比为0.1％的三氟乙酸洗涤。
13、进一步的，所述初级样本用c18萃取柱除盐具体为：将所述初级样本装载到c18萃取柱上，在重力作用下所述初级样本通过所述c18萃取柱，将洗脱液重新装载到所述c18萃取柱上，保证糖肽和多肽与c18充分结合，再用900-1000微升体积百分比为0.1％的三氟乙酸冲洗所述c18萃取柱，重复4-6次，最后用600-800微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液将糖肽和多肽从c18萃取柱上洗脱。
14、进一步的，在步骤(2)中，所述利用固相氨基苯并硼酸衍生物介质特异性富集样本中的糖肽，得到已连接上糖肽的固相介质具体为：将所述含有糖肽和多肽的样本真空离心干燥，得到固体的肽混合物，将所述肽混合物溶解在100毫摩尔醋酸铵缓冲液中，并与固相氨基苯并硼酸衍生物在室温下孵育1-2小时，使得所述固相氨基苯并硼酸衍生物和糖肽结合，得到已连接上糖肽的固相介质。
15、进一步的，在步骤(3)中，利用n-糖苷酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行n-糖基化分析，并定量检测n-糖蛋白具体为：用结合缓冲液洗涤所述已连接上糖肽的固相介质，配制20-30mm碳酸氢铵溶液，在洗涤后的所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升碳酸氢铵溶液和0.2-0.4微升pngase f糖苷酶，在47℃下孵育2-3小时来酶切所述已连接上糖肽的固相介质，使得去聚糖的n-糖肽富集，然后通过用体积百分比为10％的乙腈来洗脱酶切仍保留在固相介质上的去聚糖n-糖肽，收集去聚糖n-糖肽。
16、进一步的，在步骤(4)中，所述使用galnacexo酶来切割所述已连接上糖肽的固相介质中带有galnac的o-糖基化位点，获得tn抗原o-糖肽具体为：配制1×pbs溶液，在所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升1×pbs溶液和4-5微升浓度为20u/微升galnacexo的o-糖苷酶，在37℃下孵育6-8小时，酶切，并用300-400微升1×pbs溶液洗涤2-3次，得到tn抗原o-糖肽。
17、进一步的，在步骤(5)中，所述利用o-glycosidase酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行切割分析，从而得到t抗原o-糖肽具体为：配制20-30mm碳酸氢铵溶液，在所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升碳酸氢铵溶液和10-20微升浓度为40,000u/微升的o-glycosidase，在37℃下孵育1-4小时，酶切，并用20-30mm碳酸氢铵溶液洗涤2-3次，得到t抗原o-糖肽。
18、进一步的，在步骤(6)中，所述使用operator富集具有无唾液酸修饰的复杂o-聚糖糖肽具体为：用200-300微升浓度为50-100u/微升的operator、ph为6.8的1×tris.hcl溶液在37℃下孵育所述已连接上糖肽的固相介质8-16小时，切除具有无唾液酸修饰的复杂o-聚糖糖肽。
19、进一步的，在步骤(7)中，所述使用impa富集唾液酸化复杂o-糖肽具体为：将所述已连接上糖肽的固相介质与50-100u的impa在300-400微升1×pbs溶液中，37℃下孵育2-3小时，酶切，并用1×pbs溶液洗涤2-3次，得到唾液酸化复杂o-糖肽。
20、本专利技术提供了一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其优点在于：
21、(1)可对同一蛋白样本进行酶解后，多步骤分析蛋白n-糖基化位点、o-glcnac位点、t抗原位点、tn抗原位点，以及具有唾液酸修饰的复杂o-糖肽位点和无唾液酸修饰的复杂o-糖肽位点；
22、(2)该方法可与自动化系统结合，实现高通量样本全方位的糖基化分析。
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1.一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述通过胰蛋白酶酶解糖蛋白形成糖肽和多肽具体为：将含有糖蛋白的样本在15,000×g离心10-15分钟，取1-2微升上清液测试蛋白浓度，根据测试蛋白浓度的结果取500-1000微克蛋白质，加入5-10微克胰蛋白酶，调节pH7.4-8.0，37℃酶解16-18小时，得到含有肽段和盐的复杂溶液样本，将所述复杂溶液样本溶解在体积百分比为0.1％的三氟乙酸的HPLC水溶液中，控制总体积为1-2毫升，得到初级样本，所述初级样本用C18萃取柱除盐，获得含有糖肽和多肽的样本。
3.根据权利要求2所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于：所述初级样本用C18萃取柱除盐之前，先将C18萃取柱用900-1000微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液洗涤萃取柱两次，再
4.根据权利要求3所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，所述初级样本用C18萃取柱除盐具体为：将所述初级样本装载到C18萃取柱上，在重力作用下所述初级样本通过所述C18萃取柱，将洗脱液重新装载到所述C18萃取柱上，保证糖肽和多肽与C18充分结合，再用900-1000微升体积百分比为0.1％的三氟乙酸冲洗所述C18萃取柱，重复4-6次，最后用600-800微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液将糖肽和多肽从C18萃取柱上洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述利用固相氨基苯并硼酸衍生物介质特异性富集样本中的糖肽，得到已连接上糖肽的固相介质具体为：将所述含有糖肽和多肽的样本真空离心干燥，得到固体的肽混合物，将所述肽混合物溶解在100毫摩尔醋酸铵缓冲液中，并与固相氨基苯并硼酸衍生物在室温下孵育1-2小时，使得所述固相氨基苯并硼酸衍生物和糖肽结合，得到已连接上糖肽的固相介质。
6.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于：在步骤(3)中，利用N-糖苷酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行N-糖基化分析，并定量检测N-糖蛋白具体为：用结合缓冲液洗涤所述已连接上糖肽的固相介质，配制20-30mM碳酸氢铵溶液，在洗涤后的所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升碳酸氢铵溶液和0.2-0.4微升PNGase F糖苷酶，在47℃下孵育2-3小时来酶切所述已连接上糖肽的固相介质，使得去聚糖的N-糖肽富集，然后通过用体积百分比为10％的乙腈来洗脱酶切仍保留在固相介质上的去聚糖N-糖肽，收集去聚糖N-糖肽。
7.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述使用GalNAcEXO酶来切割所述已连接上糖肽的固相介质中带有GalNAc的O-糖基化位点，获得Tn抗原O-糖肽具体为：配制1×PBS溶液，在所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升1×PBS溶液和4-5微升浓度为20U/微升GalNAcEXO的O-糖苷酶，在37℃下孵育6-8小时，酶切，并用300-400微升1×PBS溶液洗涤2-3次，得到Tn抗原O-糖肽。
8.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述利用O-Glycosidase酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行切割分析，从而得到T抗原O-糖肽具体为：配制20-30mM碳酸氢铵溶液，在所述已连接上糖肽的固相介质中加入300-400微升碳酸氢铵溶液和10-20微升浓度为40,000U/微升的O-glycosidase，在37℃下孵育1-4小时，酶切，并用20-30mM碳酸氢铵溶液洗涤2-3次，得到T抗原O-糖肽。
9.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位N-和O-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述使用OpeRATOR富集具有无唾液酸修饰的复杂O-聚糖糖肽具体为：用200-300微升浓度为50-100U/微升的OpeRATOR、pH为6.8的...
【技术特征摘要】
1.一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述通过胰蛋白酶酶解糖蛋白形成糖肽和多肽具体为：将含有糖蛋白的样本在15,000×g离心10-15分钟，取1-2微升上清液测试蛋白浓度，根据测试蛋白浓度的结果取500-1000微克蛋白质，加入5-10微克胰蛋白酶，调节ph7.4-8.0，37℃酶解16-18小时，得到含有肽段和盐的复杂溶液样本，将所述复杂溶液样本溶解在体积百分比为0.1％的三氟乙酸的hplc水溶液中，控制总体积为1-2毫升，得到初级样本，所述初级样本用c18萃取柱除盐，获得含有糖肽和多肽的样本。
3.根据权利要求2所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于：所述初级样本用c18萃取柱除盐之前，先将c18萃取柱用900-1000微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液洗涤萃取柱两次，再用900-1000毫升体积百分比为0.1％的三氟乙酸洗涤。
4.根据权利要求3所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，所述初级样本用c18萃取柱除盐具体为：将所述初级样本装载到c18萃取柱上，在重力作用下所述初级样本通过所述c18萃取柱，将洗脱液重新装载到所述c18萃取柱上，保证糖肽和多肽与c18充分结合，再用900-1000微升体积百分比为0.1％的三氟乙酸冲洗所述c18萃取柱，重复4-6次，最后用600-800微升体积百分比为50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸溶液将糖肽和多肽从c18萃取柱上洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述利用固相氨基苯并硼酸衍生物介质特异性富集样本中的糖肽，得到已连接上糖肽的固相介质具体为：将所述含有糖肽和多肽的样本真空离心干燥，得到固体的肽混合物，将所述肽混合物溶解在100毫摩尔醋酸铵缓冲液中，并与固相氨基苯并硼酸衍生物在室温下孵育1-2小时，使得所述固相氨基苯并硼酸衍生物和糖肽结合，得到已连接上糖肽的固相介质。
6.根据权利要求1所述的一种基于固相氨基苯并硼酸衍生物在全方位n-和o-连接糖基化位点特异性中的分析方法，其特征在于：在步骤(3)中，利用n-糖苷酶对所述已连接上糖肽的固相介质进行n-糖基化分析...
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