本发明专利技术公开了一种固定化生物膜制备R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸的方法。该方法不仅操作简单、条件温和，同时能够提升R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸的产量，使R‑HPPA产量达到了52.30g/L，此外该固定化球孢白僵菌生物膜可以多批次的生产R‑HPPA，简化了工艺操作，缩短了发酵周期，降低了工业化生产成本。
1、苯氧基除草剂是一类选择性地抑制双子叶植物的生长和发育的除草剂，它可以刺激乙烯和脱落酸的合成，破坏植物的蛋白质合成、细胞分裂和生长，因其具有成本低、除草效果快、杀草谱广的特点，在生产中发挥着重要作用。
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸（
r-hppa）是苯氧基除草剂合成过程中的的关键中间体，因此，开发
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸制备方法备受关注。
2、目前可以通过立体选择性专一、反应条件温和、环境友好的生物法制备
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。如利用球孢白僵菌生物膜发酵催化
r-2-苯氧基丙酸合成
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。生物膜是由生物群体及其包被的细胞外多聚物和基质网组成，并且许多研究表明，生物膜发酵能够有更高的产酶量。然而球孢白僵菌生物膜发酵容易受到生物膜脆弱易破裂等因素的限制，无法有效生产
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。因此，开发一种适用于球孢白僵菌生物膜以生产
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸具有重要的现实意义。
>1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种固定化生物膜制备
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，不仅操作简单、条件温和，同时能够提升
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的产量。
2、本专利技术解决上述问题的技术方案如下：
3、一种固定化生物膜制备
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，包括以下步骤：
4、s1、将球孢白僵菌zjb23323菌株单菌落接种至液态的活化培养基，在23~33℃、150~250rpm下浸没培养2~4d；
5、s2、将步骤s1的培养物按照5~20%体积百分比接种至含有固定化载体的发酵培养基中，在23~33℃下，静态培养11~15d进行固定化生物膜发酵，发酵培养基包括：
r-2-苯氧基丙酸40~60g/l、葡萄糖30~50g/l、酵母提取物5~15g/l、 mgso40.9~1.1g/l、 cacl20.65~0.85g/l、 k2hpo41.7~1.9g/l、 kh2po40.65~0.85g/l、微量元素40~60ml/l，溶剂为水，ph6.0~7.6；所述微量元素包括以下组分：edta-2na·2h2o 1~3g/l、feso4·7h2o 0.4~0.8g/l、znso4·7h2o 0.1~0.3g/l、mnso4·h2o 0.1~0.3g/l、nicl·6h2o 0.02~0.06g/l、cocl20.01~0.03g/l、h3bo30.02~0.04g/l、na2moo4·h2o 0.003~0.007g/l；所述固定化载体选自聚氨酯海绵、浮石、丝瓜络、pes颗粒、eva泡沫珠、多孔石头、pp滤纸中的一种或多种；
6、s3、将步骤s2中培养完成的发酵液分离纯化，获得
r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。
7、作为优选，所述聚氨酯海绵厚度为0.5~1.5cm。
8、作为优选，所述聚氨酯海绵厚度为0.5~1.5cm，步骤s2中温度为24~32℃，步骤s2中ph为6.4~7.2。
9、作为优选，所述聚氨酯海绵厚度为1cm，步骤s2中温度为28℃，步骤s2中ph为6.8。
10、作为优选，分别在步骤s2的第2~3d、4~5d、6~7d、8~9d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
11、作为优选，分别在步骤s2的第2~3d、4~5d向发酵培养基中加入体积分数为3~7%的100~300g/l无菌酵母提取物溶液。
12、作为优选，所述发酵液移除后，再在原有容器中接入与步骤s2等量的发酵培养基，进行5~7d的第二批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第二批发酵液；分别在第2~3d、4~5d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
13、作为优选，所述第二批发酵液移除后，再接入与步骤s2中等量的发酵培养基，进行5~7d的第三批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第三批发酵液；分别在第2~3d、4~5d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
14、作为优选，所述第三批发酵液移除后，再接入与步骤s2中等量的发酵培养基，进行7~9d的第四批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第四批发酵液；分别在第2~3d、4~5d、6~7d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
15、作为优选，所述第四批发酵液移除后，再接入与步骤s2中等量的发酵培养基，进行7~9d的第五批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第五批发酵液；分别在第2~3d、4~5d、6~7d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
16、作为优选，所述第五批发酵液移除后，再接入与步骤s2中等量的发酵培养基，进行7~9d的第六批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第六批发酵液；分别在第2~3d、4~5d、6~7d向发酵培养基中加入体积分数为5~15%的500~700g/l无菌葡萄糖溶液。
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【技术保护点】
1.一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述聚氨酯海绵厚度为0.5～1.5cm。
3.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述聚氨酯海绵厚度为0.5～1.5cm，步骤S2中温度为24～32℃，步骤S2中pH为6.4～7.2。
4.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，分别在步骤S2的第2～3d、4～5d、6～7d、8～9d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
5.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，分别在步骤S2的第2～3d、4～5d向发酵培养基中加入体积分数为3～7％的100～300g/L无菌酵母提取物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述发酵液移除后，再在原有容器中接入与步骤S2等量的发酵培养基，进行5～7d的第二批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤S2相同，发酵完成后，移除第二批发酵液；分别在第2～3d、4～5d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
7.根据权利要求6所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述第二批发酵液移除后，再接入与步骤S2中等量的发酵培养基，进行5～7d的第三批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤S2相同，发酵完成后，移除第三批发酵液；分别在第2～3d、4～5d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
8.根据权利要求7所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述第三批发酵液移除后，再接入与步骤S2中等量的发酵培养基，进行7～9d的第四批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤S2相同，发酵完成后，移除第四批发酵液；分别在第2～3d、4～5d、6～7d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
9.根据权利要求8所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述第四批发酵液移除后，再接入与步骤S2中等量的发酵培养基，进行7～9d的第五批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤S2相同，发酵完成后，移除第五批发酵液；分别在第2～3d、4～5d、6～7d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
10.根据权利要求9所述的一种固定化生物膜制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述第五批发酵液移除后，再接入与步骤S2中等量的发酵培养基，进行7～9d的第六批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤S2相同，发酵完成后，移除第六批发酵液；分别在第2～3d、4～5d、6～7d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/L无菌葡萄糖溶液。
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【技术特征摘要】
1.一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述聚氨酯海绵厚度为0.5～1.5cm。
3.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述聚氨酯海绵厚度为0.5～1.5cm，步骤s2中温度为24～32℃，步骤s2中ph为6.4～7.2。
4.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，分别在步骤s2的第2～3d、4～5d、6～7d、8～9d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/l无菌葡萄糖溶液。
5.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，分别在步骤s2的第2～3d、4～5d向发酵培养基中加入体积分数为3～7％的100～300g/l无菌酵母提取物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述发酵液移除后，再在原有容器中接入与步骤s2等量的发酵培养基，进行5～7d的第二批次固定化细胞培养及发酵，除时间外其余培养条件与步骤s2相同，发酵完成后，移除第二批发酵液；分别在第2～3d、4～5d向发酵培养基中加入体积分数为5～15％的500～700g/l无菌葡萄糖溶液。
7.根据权利要求6所述的一种固定化生物膜制备r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法，其特征在于，所述第二批发酵液移除后...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹树平，陈晓敏，薛亚平，马逸之，胡忠策，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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