庆大霉素液相芯片探针的制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫化学技术领域的一种庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其通过采用碳化二亚胺法，以甘氨酸、３－氨基丙酸或４－氨基丁酸修饰羧基化聚苯乙烯荧光微球表面，再通过碳化二亚胺法将庆大霉素分子标记到荧光微球表面的方式，制成庆大霉素液相芯片探针。该庆大霉素液相芯片探针的制备方法简便操作，稳定性好，且产物具有优良的庆大霉素靶向性，可为庆大霉素的液相芯片测试技术开发提供了更为方便的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫化学
的一种庆大霉素检测试剂的制备方法，尤其涉及一 种。
技术介绍
庆大霉素(Gentamicin)属氨基糖苷类抗生素药物，对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、 沙门氏菌、肺炎球菌、变形杆菌属、肠杆菌属、巴斯德氏菌、志贺菌属等具有高度的抗菌活 性，在人类及家畜临床中应用广泛。庆大霉素的毒副作用为具有一定的肾毒性和肝毒性。动 物治疗中，由于不规范用药等原因，导致在动物组织及食品中残留庆大霉素，从而会带来一 定的食品安全风险。因此，许多国家都对庆大霉素在动物组织或动物源食品中规定了最大 残留限量。对于动物食品中庆大霉素的残留，国内外多以色谱-质谱联用法、酶联免疫法为 主，色谱-质谱联用法检测灵敏度高，但是对实验室仪器和人员要求高，检测方法复杂，检 测通量较低，成本较高，实际中难以满足大量样本的检测需求。酶联免疫法检测成本较低， 但是一般检测药物种类单一，检测线性范围窄。液相芯片技术是美国Luminex公司开发的一种多功能的分析平台。它将流式检测 与芯片技术有机地结合在一起，在保持高通量检测的同时，将反应体系由液相-固相反应 改变为液相反应体系，对于确保高级结构之上的蛋白质相互作用尤为关键。液相芯片技术 的载体是聚苯乙烯所制作的微珠，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，可产生100种不 同比例颜色的微珠，每一种用于标记探针的微珠都带有一个独特的色彩编号。每一种微球 采用不同探针标记，并将标记探针的微珠与待测物在液相中反应，反应产物通过液相芯片 的检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通信道，通过两种激光检激发测，红色激光可定 位微球的编码地址，绿色激光则激发待测样本的报告分子(R-澡红蛋白)实现样本目标物 的定量分析。液相芯片的检测模式可以实现检测目标物的多样性，对样品利用率高，检测速 度快，可根据实际检测对象的需要对不同种类的探针进行组合，灵活性大。近年来，在液相芯片系统中实现了对小分子药物的检测。小分子药物液相芯片探 针的制备工艺常见的方法为首先制备小分子半抗原与载体蛋白的偶联物，然后将这种偶 联物与羧基化的荧光微球反应，从而得到该小分子的液相芯片探针。这种工艺采用载体蛋 白为连接臂，由于载体蛋白与小分子偶联反应以及偶联物与微球的反应重复性较差，限制 了其实际中的应用推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种，其采用在液相芯 片用的荧光微球表面标记庆大霉素分子的方式，构建出一种可特异性识别庆大霉素抗体的 新型免疫分析固相界面，其可进一步开发应用于庆大霉素的液相芯片模式检测，从而克服 了现有技术的不足。4为实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案一种，其特征在于，该方法为(1)取羧基化聚苯乙烯荧光微球均勻分散于pH值为6. 0 7. 0，含0. 05M 0. 2M 的磷酸盐缓冲溶液中，经超声处理后，再加入过量新鲜配置的50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺 磺酸盐和50mg/ml水溶性碳二亚胺水溶液，均勻混合后，室温下暗处震荡孵育15 30min， 而后离心移去上清，加入过量0. 01 % 0. 1 %的甘氨酸、3-氨基丙酸或4-氨基丁酸溶液， 均勻混合后，室温下暗处孵育15 30min后，离心移去上清，以pH值为7. 2 8. 0、浓度为 0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得初次活化后的荧光微球；(2)将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含50mg/ml氮羟基琥珀 酰亚胺磺酸盐和50mg/ml水溶性碳二亚胺的水溶液中，均勻混合后，室温下暗处震荡孵育 15 30min，完成对荧光微球的再次活化，其后加入过量的含0. 01 1 μ g/mL庆大霉素的 磷酸盐缓冲溶液，室温下暗处震荡孵育1 2h，离心移去上清，以pH值为7. 2 8. 0、浓度 为0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得目标产物庆大霉素液相芯片探针。进一步地讲步骤(1)中，所述羧基化聚苯乙烯荧光微球是经水洗处理后，再被分 散于PH值为6. 0 7. 0、浓度为0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液中的。步骤(1)中，所述超声处理的时间为1 5min，超声频率为20KHz。所述庆大霉素液相芯片探针是被悬浮于贮存液中保藏的，所述贮存液为pH值为 7. 2 8. 0，浓度为0. 05M 0. 2M的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其含0. 1 1. Owt %牛血清白 蛋白、0. 01 0. 05wt%吐温-20和0. Iwt %叠氮钠。所述磷酸缓冲盐溶液为含0. 8% WtNaCl的磷酸盐缓冲液。该方法具体为(1)取羧基化聚苯乙烯荧光微球经过水洗，离心并去除上清液后，加入pH值为 6. 0 7. 0、浓度为0. 05M 0. 2M磷酸盐缓冲溶液中，令该磷酸盐缓冲溶液中所含荧光微球 的浓度为5 X IO3 2. 5 X IO4个/ μ L，漩涡混合lmin，然后超声1 5min，而后加入过量新 鲜配置的50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐水溶液和50mg/ml水溶性碳二亚胺水溶液，漩 涡混合IOs后，形成混合反应溶液，而后将该混合反应溶液于室温下暗处震荡孵育20min， 孵育完成后，离心移去上清，将沉淀分散于浓度为0. 01wt% 0. 的甘氨酸、3-氨基丙 酸或4-氨基丁酸溶液中，并于室温下暗处再次孵育15 30min，而后离心移去上清，沉淀以 PH值为7. 2 8. 0、浓度为0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，制得初次活化后的 荧光微球；(2)将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含50mg/ml氮羟基琥珀酰 亚胺磺酸盐和50mg/ml水溶性碳二亚胺的水溶液中，漩涡混合IOs后，室温下暗处震荡孵 育20min，完成对荧光微球的再次活化，其后加入过量的含0.01 1 μ g/mL庆大霉素的磷 酸盐缓冲溶液，室温下暗处震荡孵育1 2h，离心移去上清，以pH值为7. 2 8. 0、浓度为 0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物两次，制得目标产物庆大霉素液相芯片探针， 该该目标产物悬浮于贮存液中保存，所述贮存液采用pH值为7. 2 8. 0，浓度为0. 05M 0. 2M的PBS溶液，其含0. 1 1.血清白蛋白、0. 01 0. 05wt%吐温-20和0. 05 0. 2 丨％叠氮钠。本专利技术采用两步法在荧光微球表面标记庆大霉素，第一步采用水溶性碳化二亚胺法将微球表面的羧基与连接臂(对位、间位或邻位的氨基苯甲酸)的氨基偶联，第二步再同 法将连接臂的羧基与庆大霉素分子的氨基偶联，每一步反应都是定向的，微球表面标记探 针的量可以通过调节庆大霉素分子的浓度实现控制和重复。与现有技术，如常见的载体蛋白作为连接臂的方法相比，本专利技术的有益效果在于 该简便操作，可控性强，重复性好，稳定性好，产率高，纯 度高，且产物具有优良的庆大霉素靶向性，可为庆大霉素的液相芯片测试技术开发提供了 更为方便的途径。具体实施例方式实施例1该原理如下式所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其特征在于，该方法为：（１）取羧基化聚苯乙烯荧光微球均匀分散于ｐＨ值为６．０～７．０，含０．０５Ｍ～０．２Ｍ的磷酸盐缓冲液中，经超声处理后，再加入过量新鲜配置的５０ｍｇ／ｍｌ氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和５０ｍｇ／ｍｌ水溶性碳二亚胺水溶液，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育１５～３０ｍｉｎ，而后离心移去上清，加入过量０．０１％～０．１％的甘氨酸、３－氨基丙酸或４－氨基丁酸溶液，均匀混合后，室温下暗处孵育１５～３０ｍｉｎ后，离心移去上清，以ｐＨ值为７．２～８．０、浓度为０．０５Ｍ～０．２Ｍ的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得初次活化后的荧光微球；（２）将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含５０ｍｇ／ｍｌ氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和５０ｍｇ／ｍｌ水溶性碳二亚胺的水溶液中，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育１５～３０ｍｉｎ，完成对荧光微球的再次活化，其后加入过量的含０．０１～１μｇ／ｍＬ庆大霉素的磷酸盐缓冲溶液，室温下暗处震荡孵育１～２ｈ，离心移去上清，以ｐＨ值为７．２～８．０、浓度为０．０５Ｍ～０．２Ｍ的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得目标产物庆大霉素液相芯片探针。

【技术特征摘要】
一种庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其特征在于，该方法为(1)取羧基化聚苯乙烯荧光微球均匀分散于pH值为6.0～7.0，含0.05M～0.2M的磷酸盐缓冲液中，经超声处理后，再加入过量新鲜配置的50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50mg/ml水溶性碳二亚胺水溶液，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育15～30min，而后离心移去上清，加入过量0.01％～0.1％的甘氨酸、3 氨基丙酸或4 氨基丁酸溶液，均匀混合后，室温下暗处孵育15～30min后，离心移去上清，以pH值为7.2～8.0、浓度为0.05M～0.2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得初次活化后的荧光微球；(2)将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含50mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50mg/ml水溶性碳二亚胺的水溶液中，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育15～30min，完成对荧光微球的再次活化，其后加入过量的含0.01～1μg/mL庆大霉素的磷酸盐缓冲溶液，室温下暗处震荡孵育1～2h，离心移去上清，以pH值为7.2～8.0、浓度为0.05M～0.2M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得目标产物庆大霉素液相芯片探针。2.根据权利要求1所述的庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其特征在于步骤(1) 中，所述羧基化聚苯乙烯荧光微球是经水洗处理后，再被分散于PH值为6. 0 7. 0、浓度为 0. 05M 0. 2M的磷酸盐缓冲溶液中的。3.根据权利要求1所述的庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其特征在于步骤(1) 中，所述超声处理的时间为1 5min，超声频率为20KHz。4.根据权利要求1所述的庆大霉素液相芯片探针的制备方法，其特征在于所述庆大 霉素液相芯片探针是被悬浮于贮存液中保藏的，所述贮存液为PH值为7. 2 8. 0，浓度为 0. 05M 0. 2M的磷酸缓冲盐溶液，其含0. 1 1.血清白蛋白、0. 01 0. 05界1%吐 温-20和0. Iwt %叠氮钠。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭池方，陈伟，匡华，刘丽强，胥传来，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[]