【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛诺如病毒检测，尤其是涉及牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法及应用。
技术介绍
1、犊牛腹泻常发于不足一月龄犊牛，极易造成犊牛生长发育不良、生长周期延长、继发感染甚至死亡，严重危害我国犊牛成活率，给养牛业造成巨大经济损失。犊牛腹泻发病原因主要包括传染性和非传染性的，传染性的病因主要由病毒、细菌和原生动物引起，非传染性因素主要包括初乳摄取不足、育种不卫生、喂养不当等因素。除此以外，腹泻犊牛常出现混合感染的情况，导致临床防治难度大。其中，病毒所致犊牛腹泻是最常见、最严重的疾病之一。
2、研究发现，新疆地区危害犊牛的病毒性腹泻病原主要有牛诺如病毒(bovinenorovirus,bnov)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,bcov)、牛轮状病毒(bovinerotavirus,brv)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bvdv)等，而bnov作为近几年备受关注的腹泻病原，在新疆南疆地区检出率高达25.07％。
3、bnov作为一种新发病原，以腹泻为主要临床症状，常伴有呕吐，精神沉郁等，具有高度感染性，其导致的临床症状与brv、bcov、bvdv相似，又常与其他病毒发生混合感染而加重腹泻严重度；且腹泻和非腹泻犊牛之间病毒载量无差异，单凭临床症状很难判断，给诊断以及后续治疗带来极大困难，目前尚无针对bnov的商品化疫苗和治疗药物，也无快速有效的早期检测技术。因此，建立一种快速、灵敏、特异性高的检测方法对于bnov诊断具有重要意义。
4、bnov是杯状病毒科、圆形、无囊膜单股正链rna病毒，直径25nm-40nm，共有三个开放阅读框(orf)，位于5′端的orf1大小约为195ku，共包含6种蛋白，分别为ns1-2(p48)、ns3核苷三磷酸酶、ns4蛋白(p22)、ns5蛋白(vpg)、ns6(3c样蛋白)和rna依赖性rna聚合酶(rdrp)，负责编码病毒的非结构蛋白；orf2编码主要衣壳蛋白vp1，大小约为60ku；orf3位于基因组的3′末端，编码次要结构蛋白vp2，大小约20ku，可能参与衣壳组装和基因组衣壳化，且关乎vp1蛋白的表达稳定性。由于rdrp基因是bnov遗传与进化的重要基因之一，该基因较短，更易获得，所以常常被作为检测bnov时的靶基因。
5、重组酶介导等温扩增(recombinase aided amplification,raa)技术，是利用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶三大要素对目的片段进行扩增，是一种时间较短、灵敏度高、特异性强、成本较低、适合现场检测的恒温扩增技术。在37℃～42℃，30min即可完成扩增产物的指数级增长。raa扩增后产物的检测可以结合琼脂糖凝胶电泳、荧光信号、横向流动试纸条等不同方法。其中，荧光信号检测法相较于琼脂糖法与试纸条法灵敏度更高。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法及应用，以提供一种检测方便、快速，检测结果稳定可靠，最低检出限低，特异性好的早期牛诺如病毒检测技术。
2、为实现上述目的，本专利技术提供牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法及应用，牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，步骤如下：
3、s1、扩增bnov的rdrp基因保守序列，然后连接到peasy-t1载体形成重组质粒，命名为peasy-bnov；
4、s2、以重组质粒peasy-bnov设计引物，并筛选获得最佳raa-exo引物对；
5、s3、用获得的最佳raa-exo引物进行条件优化，最终建立bnov raa-exo最佳检测方法。
6、优选的，步骤s1中扩增bnov的rdrp基因保守序列的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示。
7、优选的，步骤s2中筛选获得最佳raa-exo引物对的方法为：
8、s2.1、进行一级筛选，根据重组质粒peasy-bnov设计引物，将设计的引物进行raa反应，将扩增产物纯化后电泳，获得一个扩增效果最佳的引物；
9、s2.2、进行二级筛选，将一级筛选获得的最佳引物对，先固定上游引物，下游引物以1bp的量增加或减少引物长度，获得新的引物对，再进行raa反应、扩增产物纯化、电泳，获得一个扩增效果最好的引物对；
10、固定选所选出引物的下游引物，上游引物以1bp的量增加或减少引物长度，获得新的引物对，再进行raa反应、扩增产物纯化、电泳，获得一个扩增效果最好的引物对；
11、s2.3、进行三级筛选，以二级筛选得到的最佳引物对为基础，以1bp的量增加或减少引物长度，获得新的引物对，采用荧光法对新获得的引物qpcr，根据实时荧光曲线的起峰时间和荧光强度获得最佳raa-exo引物对。
12、优选的，步骤s2.1中用于一级筛选的引物为bnov-f1/r1、bnov-f2/r2、bnov-f3/r3、bnov-f4/r4；bnov-f1序列如seq id no.3所示，bnov-r1序列如seq id no.4所示；bnov-f2序列如seq id no.5所示，bnov-r2序列如seq id no.6所示；bnov-f3序列如seq id no.7所示，bnov-r3序列如seq id no.8所示；bnov-f4序列如seq id no.9所示，bnov-r4序列如seq id no.10所示；一级筛选获得的最佳引物为bnov-f4/r4。
13、优选的，步骤s2.2中用于二级筛选的引物为bnov-f4/r5、bnov-f4/r6、bnov-f4/r7、bnov-f4/r8、bnov-f4/r9、bnov-f4/r610、bnov-f5/r9、bnov-f6/r9、bnov-f7/r9、bnov-f8/r9、bnov-f9/r9、bnov-f10/r9；bnov-r5序列如seq id no.11所示，bnov-r6序列如seqid no.12所示，bnov-r7序列如seq id no.13所示，bnov-r8序列如seq id no.14所示，bnov-r9序列如seq id no.15所示，bnov-r10序列如seq id no.16所示，bnov-f5序列如seqid no.17所示，bnov-f6序列如seq id no.18所示，bnov-f7序列如seq id no.19所示，bnov-f8序列如seq id no.20所示，bnov-f9序列如seq id no.21所示，bnov-f10序列如seqid no.22所示；二级筛选获得的最佳引物为bnov-f4/r9。
14、优选的，步骤s2.3中进行三级筛选的引物为bnov-f11/r11、bnov-f12/r12、bnov-f13/r13、bnov-f14/r14；bnov-f11序列如seq id no.23所示，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于：步骤S1中扩增BNoV的RdRp基因保守序列的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤S2中筛选获得最佳RAA-EXO引物对的方法为：
4.根据权利要求3所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤S2.1中用于一级筛选的引物为BNoV-F1/R1、BNoV-F2/R2、BNoV-F3/R3、BNoV-F4/R4；BNoV-F1序列如SEQ ID NO.3所示，BNoV-R1序列如SEQ ID NO.4所示；BNoV-F2序列如SEQ IDNO.5所示，BNoV-R2序列如SEQ ID NO.6所示；BNoV-F3序列如SEQ ID NO.7所示，BNoV-R3序列如SEQ ID NO.8所示；BNoV-F4序列如SEQ ID N
5.根据权利要求3所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤S2.2中用于二级筛选的引物为BNoV-F4/R5、BNoV-F4/R6、BNoV-F4/R7、BNoV-F4/R8、BNoV-F4/R9、BNoV-F4/R610、BNoV-F5/R9、BNoV-F6/R9、BNoV-F7/R9、BNoV-F8/R9、BNoV-F9/R9、BNoV-F10/R9；BNoV-R5序列如SEQ ID NO.11所示，BNoV-R6序列如SEQ ID NO.12所示，BNoV-R7序列如SEQ ID NO.13所示，BNoV-R8序列如SEQ ID NO.14所示，BNoV-R9序列如SEQID NO.15所示，BNoV-R10序列如SEQ ID NO.16所示，BNoV-F5序列如SEQ ID NO.17所示，BNoV-F6序列如SEQ ID NO.18所示，BNoV-F7序列如SEQ ID NO.19所示，BNoV-F8序列如SEQID NO.20所示，BNoV-F9序列如SEQ ID NO.21所示，BNoV-F10序列如SEQ ID NO.22所示；二级筛选获得的最佳引物为BNoV-F4/R9。
6.根据权利要求3所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤S2.3中进行三级筛选的引物为BNoV-F11/R11、BNoV-F12/R12、BNoV-F13/R13、BNoV-F14/R14；BNoV-F11序列如SEQ ID NO.23所示，BNoV-R11序列如SEQ ID NO.24所示，BNoV-F12序列如SEQ ID NO.25，BNoV-R12序列如SEQ ID NO.26所示，BNoV-F13序列如SEQ IDNO.27，BNoV-R13序列如SEQ ID NO.28所示，BNoV-F14序列如SEQ ID NO.29，BNoV-R14序列如SEQ ID NO.30所示；探针序列如SEQ ID NO.31所示；获得的最佳RAA-EXO引物对为F12/R12。
7.根据权利要求1所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法，其特征在于：步骤S3中建立的BNoV RAA-EXO最佳检测方法，以BNoV-F12/R12为引物，50μL体系探针用量为4×10-12mol/L，反应条件为41℃反应20min。
8.如权利要求1-7任一项所述的牛诺如病毒RAA-EXO精准检测技术的建立方法在牛诺如病毒检测中的应用，其特征在于：应用范围包括牛犊和成年牛。
...【技术特征摘要】
1.牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，其特征在于：步骤s1中扩增bnov的rdrp基因保守序列的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤s2中筛选获得最佳raa-exo引物对的方法为：
4.根据权利要求3所述的牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤s2.1中用于一级筛选的引物为bnov-f1/r1、bnov-f2/r2、bnov-f3/r3、bnov-f4/r4；bnov-f1序列如seq id no.3所示，bnov-r1序列如seq id no.4所示；bnov-f2序列如seq idno.5所示，bnov-r2序列如seq id no.6所示；bnov-f3序列如seq id no.7所示，bnov-r3序列如seq id no.8所示；bnov-f4序列如seq id no.9所示，bnov-r4序列如seq id no.10所示；一级筛选获得的最佳引物为bnov-f4/r4。
5.根据权利要求3所述的牛诺如病毒raa-exo精准检测技术的建立方法，其特征在于，步骤s2.2中用于二级筛选的引物为bnov-f4/r5、bnov-f4/r6、bnov-f4/r7、bnov-f4/r8、bnov-f4/r9、bnov-f4/r610、bnov-f5/r9、bnov-f6/r9、bnov-f7/r9、bnov-f8/r9、bnov-f9/r9、bnov-f10/r9；bnov-r5序列如seq id no.11所示，bnov-r6序列如seq id no.12所示，bnov-r7序列如seq id no.13所...
【专利技术属性】
技术研发人员：马雪连，王新皓，姚刚，刘文进，赵璐，李娜，孙亚伟，李红波，周振勇，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：
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