【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物污水处理，具体是涉及一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株及其筛选方法。
技术介绍
1、
2、
3、目前化工园区综合废水有机污染物丰度高，可生化程度低，引入工程菌是强化化工园区综合废水中有机污染物去除较为流行的手段，但高浓度、难降解有机物抑制生化系统微生物群落的生理生化活性。
4、9-甲基鸟嘌呤作为抗生素类中新污染物的一种，其结构复杂且稳定。此外，通过分析化工园区废水中有机污染物的组成成分结果表明，9-甲基鸟嘌呤在污水污染物中占比很高且在好氧处理阶段难以被降解。
5、但是，关于9-甲基鸟嘌呤的特定性降解菌株，目前并未有人对此进行筛选与应用。所以如何通过微生物方法降解9-甲基鸟嘌呤成为亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是：现有技术缺乏通过微生物降解9-甲基鸟嘌呤的方案。
2、为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：
3、一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctcc no:m 20231640。
4、作为本专利技术的一个方面，特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株bacillus sp.mg-1分离自活性污泥。
5、作为本专利技术的一个方面，活性污泥来自污水处理厂回流池。
6、作为本专利技术的一个方面，特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株的分子生物学鉴定方法包括以下内容：以纯化后的菌株的菌液作为模板，进行p
7、作为本专利技术的一个方面，pcr扩增的引物选取通用引物对27f/1492r；pcr扩增的参数为：a.1×(5minutes at 95℃)；b.27×(30seconds at 95℃；30seconds at 55℃；45seconds at 72℃)；c.10minutes at 72℃，10℃ until halted by user；pcr扩增的体系为50μl反应体系，包括10μl的5×fastpfu buffer、2μl的2.5mm dntps、1μl的forwardprimer(5μm)、1μl的reverse primer(5μm)、0.5μl的fastpfu polymerase、10ng的templatedna及补至50μl的ddh2o。
8、说明：聚合酶链式反应简称pcr(polymerase chain reaction)(又称:多聚酶链式反应)pcr是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有dna，rna的地方。pcr又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术。
9、本专利技术还提供了一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，包括以下步骤：
10、s1、活性污泥样品预处理；
11、s2、富集培养菌株，得到富集菌种；
12、s3、驯化培养菌株，得到菌悬液；
13、s4、初筛菌株，得到复筛平板；
14、s5、复筛菌株。
15、作为本专利技术的一个方面，步骤s1包括以下内容：在菌株驯化前，对活性污泥样品进行淘洗，选取750ml活性污泥混悬液，向活性污泥混悬液中加入250ml磷酸缓冲液并混匀后；静置待污泥和水相分层后，排掉上清液；重复上述操作3～5次，得到预处理后的活性污泥样品。
16、说明：磷酸缓冲液为pbs缓冲液，浓度为0.02m，ph值为7.2。
17、作为本专利技术的一个方面，步骤s2包括以下内容：将步骤s1得到的1ml活性污泥样品在含有9-甲基鸟嘌呤的lb培养基中摇瓶培养，即在30℃、150rpm环境下，将活性污泥样品中的菌株扩繁至对数生长期；在8000rpm下将lb培养基离心5min，排掉上清液，再通过磷酸缓冲液对菌体沉淀冲洗2次，得到富集菌种。
18、说明：对数生长期的判断标准为od600为1.6；lb培养基的成分为：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，nacl 10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l。
19、作为本专利技术的一个方面，步骤s3包括以下内容：分别取3ml富集菌种加入9-甲基鸟嘌呤浓度为5mg/l、10mg/l和20mg/l、总量为150ml的选择性液体培养基中，加入0.1％体积的微量元素；在30℃、150rpm环境对富集菌种进行培养；每隔24h取样一次测定od600，直至od600为1.6后停止培养；再将三个选择性液体培养基在8000rpm下离心10min，排掉上清，收集500ul菌体沉淀并用灭菌的500ul的pbs缓冲液将其稀释成1ml的菌悬液。
20、说明：选择性液体培养基的成分为：na2hpo4·12h2o 3.8g/l，kh2po41.0g/l,kcl3.0g/l，mnso4·7h2o 0.2g/l，(nh4)2so4 0.93g/l；微量元素的成分为：edta 52000mg/l，znso4·7h2o 144mg/l，cocl2·6h2o 190mg/l，mncl2·4h2o 100mg/l，cucl2·2h2o 190mg/l，na2moo4·2h2o 36mg/l，nicl2·6h2o 24mg/l，h3bo4 100mg/l,feso4·7h2o 100mg/l。
21、作为本专利技术的一个方面，将15ml固体分离培养基倒平板后冷却凝固，并在平板表面滴加150μl的9-甲基鸟嘌呤，盖上平板盖，备用；分别取1ml菌悬液并稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，得到六个梯度稀释液；分别将1ml的六个梯度稀释液滴加到平板上并涂抹均匀；将平板置于恒温培养箱中，30℃倒置培养；每48h观察记录平板内菌落的生长情况，待菌落长出后，标记最先生长出的菌落，并选取有单菌落的平板作为复筛平板。
22、作为本专利技术的一个方面，步骤s5包括以下内容：用灼烧灭菌的接种环挑取复筛平板中每个类别的优势单菌落，将接种环上的菌种在分离平板上划线；将划线后的平板置于恒温培养箱中，30℃倒置培养；每48h观察记录平板内菌落的生长状况，若复筛平板内仍存在多个菌种的单菌落，则继续挑取该平板上的单菌落进行划线培养，直至每个平板内的菌落形态完全一致为止；从每个类别菌株中选取生长较快的单菌落作为目标功能微生物，将其转移到lb培养基中进行摇瓶扩大培养；在确定筛选得到的每个菌株均为纯菌种后，进行菌种保藏，置于-80℃冰箱，备用。
23、说明：步骤s5还包括以下内容：根据复筛平板上菌落的大小、颜色、形状、边缘扩展状况和菌落表面的光滑度等项目，对复筛平板上的单菌落进行初步分类，并选取每个类别菌落中长势良好的单菌落；lb培养基的成分为：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M 20231640。
2.如权利要求1所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株Bacillus sp.MG-1分离自活性污泥。
3.如权利要求2所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述活性污泥来自污水处理厂回流池。
4.一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，用于筛选权利要求1～3任一项所述的特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，所述步骤S2包括以下内容：将步骤S1得到的1mL活性污泥样品在含有9-甲基鸟嘌呤的LB培养基中摇瓶培养，即在30℃、150rpm环境下，将活性污泥样品中的菌株扩繁至对数生长期；在8000rpm下将LB培养基离心5min，排掉上清液，再通过磷酸缓冲液对菌体沉淀冲洗2次，得到所述富集菌种。
6.如权利要求4所述的一种特定性降解9-甲
7.如权利要求6所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，所述步骤S4包括以下内容：将15mL固体分离培养基倒平板后冷却凝固，并在平板表面滴加150μL的9-甲基鸟嘌呤，盖上平板盖，备用；分别取1mL菌悬液并稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，得到六个梯度稀释液；分别将1mL的所述六个梯度稀释液滴加到所述平板上并涂抹均匀；将平板置于恒温培养箱中，30℃倒置培养；每48h观察记录平板内菌落的生长情况，待菌落长出后，标记最先生长出的菌落，并选取有单菌落的平板作为所述复筛平板。
8.如权利要求4所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，所述步骤S5包括以下内容：用灼烧灭菌的接种环挑取所述复筛平板中每个类别的优势单菌落，将接种环上的菌种在分离平板上划线；将划线后的平板置于恒温培养箱中，30℃倒置培养；每48h观察记录平板内菌落的生长状况，若复筛平板内仍存在多个菌种的单菌落，则继续挑取该平板上的单菌落进行划线培养，直至每个平板内的菌落形态完全一致为止；从每个类别菌株中选取生长较快的单菌落作为目标功能微生物，将其转移到LB培养基中进行摇瓶扩大培养；在确定筛选得到的每个菌株均为纯菌种后，进行菌种保藏，置于-80℃冰箱，备用。
9.如权利要求1所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述菌株降解9-甲基鸟嘌呤的方法为：将菌液按照体积比2％接种至污水处理厂采集的废水中，进行9-甲基鸟嘌呤降解。
10.如权利要求9所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述菌液通过将菌种转移到10ml LB培养基中进行过夜摇瓶扩大培养，培养至菌浓为OD600＝1得到。
...【技术特征摘要】
1.一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctcc no:m 20231640。
2.如权利要求1所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株bacillus sp.mg-1分离自活性污泥。
3.如权利要求2所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，所述活性污泥来自污水处理厂回流池。
4.一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，用于筛选权利要求1～3任一项所述的特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，所述步骤s2包括以下内容：将步骤s1得到的1ml活性污泥样品在含有9-甲基鸟嘌呤的lb培养基中摇瓶培养，即在30℃、150rpm环境下，将活性污泥样品中的菌株扩繁至对数生长期；在8000rpm下将lb培养基离心5min，排掉上清液，再通过磷酸缓冲液对菌体沉淀冲洗2次，得到所述富集菌种。
6.如权利要求4所述的一种特定性降解9-甲基鸟嘌呤的菌株筛选方法，所述步骤s3包括以下内容：分别取3ml所述富集菌种加入9-甲基鸟嘌呤浓度为5mg/l、10mg/l和20mg/l、总量为150ml的选择性液体培养基中，加入0.1％体积的微量元素；在30℃、150rpm环境对富集菌种进行培养；每隔24h取样一次测定od600，直至od600为1.6后停止培养；再将三个选择性液体培养基在8000rpm下离心10min，排掉上清，收集500ul菌体沉淀并用灭菌的500ul的pbs缓冲液将其稀释成1ml的菌悬液。
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