【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种对dpph自由基具有较强清除能力的抗氧化剂，具体涉及一种青霉菌lp.py-01、代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、毛冬青(ilex pubescens hook.et arn)，别名乌尾丁、六月霜，是冬青科冬青属植物，花期4-5月，果期8-11月。分布于中国安徽、浙江等地。研究发现，毛冬青树中化学成分的主要有三萜皂苷类、环烯醚萜苷类、木质素类、苯丙素类、酚酸类、黄酮类、绿原酸类。毛冬青为中国南方常用中药，有抗菌、抗炎、抗病毒、镇咳祛痰、清热解毒、消肿镇痛之功效，此外毛冬青提取物被报道具有抗疲劳和抗氧化作用。
2、植物内生菌(endophyte)是特指一类在其整个生活史或者生活史的部分阶段寄生于健康植物的部分细胞间隙、器官或者组织中，而不使宿主植物出现任何反常症状或者病症的微生物。从植物中能分离出具有多种生物活性的内生菌，其中部分内生菌通过次生代谢途径可以产生与植物次生代谢产物相似的产物。利用植物内生菌筛选生物活性成分或先导化合物已成为寻找天然药物的又一重要途径，也是当前植物内生菌研究的热点。植物内生真菌产生的抗氧化剂是从自然界中获得的天然产物，相对于合成抗氧化剂，这些物质更容易被身体吸收和利用。
3、天然来源的抗氧化剂通常对人体更友好，且有潜在的较低毒性。利用植物内生真菌生产抗氧化剂可以促进生态可持续性。这些真菌与植物形成共生关系，有助于植物的健康生长，减少了对化学农药和合成抗氧化剂的依赖，有利于生态平衡。与一些合成抗氧化剂可能引起过
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种青霉菌lp.py-01、代谢产物及在制备抗氧化剂中的应用，本专利技术青霉菌lp.py-01发酵产的代谢产物具有dpph清除活性，能够作为天然抗氧化剂，避免毛冬青植物的破坏。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一株用于发酵产抗氧化剂的青霉菌(penicilliummacrosclerotiorum)lp.py-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m20232576，保藏日期为2023年12月15日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
4、本专利技术还提供一种青霉菌lp.py-01在制抗氧化剂中的应用，所述抗氧化剂为青霉菌lp.py-01代谢产物。
5、优选的，所述抗氧化剂为dpph的清除剂。
6、本专利技术提供一种青霉菌lp.py-01的代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将青霉菌(penicillium macrosclerotiorum)lp.py-01发酵液经超声破碎后抽滤，滤液及滤渣分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并浓缩至恒重，获得代谢粗产物；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱速度均为5ml/min，洗脱量均为2～3个柱体积，收集的体积比100:5石油醚-乙酸乙酯的流出液浓缩至干，记为组分e.2；(3)将步骤(2)组分e.2用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比10:1-5:1石油醚-乙酸乙酯为流动相洗脱，收集的体积比6:1的流出液浓缩至干，记为组分e.2-3；(4)组分e.2-3用乙酸乙酯溶解后，以体积比80:20的甲醇-水为洗脱剂进行ods柱分离，收集rf值为0.5的流出液，浓缩至干，记为组分e.2-3-2；(5)步骤(4)组分e.2-3-2用少量乙酸乙酯溶解，上样于20cm*20cm制备型薄层色谱板中，以体积比5:1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂进行薄层层析，将rf为0.5的条带用刀片刮下，收集刮下的硅胶用体积比10：1的二氯-甲醇为溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，获得青霉菌lp.py-01的代谢产物。
7、进一步，步骤(1)所述发酵液按如下方法制备：将青霉菌lp.py-01接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养5d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：蛋白胨10g/l，蔗糖40g/l，溶剂为蒸馏水，ph为5.6。
8、进一步，步骤(1)所述代谢粗产物按如下方法制备：发酵液在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液超声破壁处理后抽滤，滤液用1倍体积乙酸乙酯萃取3次，滤渣用乙酸乙酯浸泡12h，合并有机相，浓缩至恒重，获得代谢粗产物。
9、进一步，所述步骤(2)是将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，混合均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中；所述硅胶与发酵粗产物质量比为1:1。
10、进一步，所述步骤(3)是将步骤(2)组分e.2用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，混合均匀后，真空干燥，即为吸附组分e.2的硅胶；将吸附组分e.2的硅胶上样于硅胶色谱柱中。
11、与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
12、本专利技术提供一株青霉菌lp.py-01及该菌株发酵提取的代谢产物e.2-3-2，代谢产物的ic50＝4.91μg/ml，阳性对照vc的ic50＝1.52μg/ml，e.2-3-2对dpph的清除能力与抗坏血酸效果相似。本专利技术通过青霉菌lp.py-01微生物发酵的方法制备得到抗氧化剂，在一定程度上避免了植被的破坏，更加安全，环保。
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1.青霉菌(Penicillium macrosclerotiorum)Lp.PY-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 20232576，保藏日期为2023年12月15日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述青霉菌Lp.PY-01在制备抗氧化剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂为青霉菌Lp.PY-01代谢产物。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂为DPPH的清除剂。
5.一种权利要求1所述青霉菌Lp.PY-01的代谢产物，其特征在于，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将青霉菌Lp.PY-01发酵液经超声破碎后抽滤，滤液及滤渣分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并浓缩至恒重，获得代谢粗产物；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱速度均为5mL/min，洗脱量均为
6.如权利要求5所述的代谢产物，其特征在于，步骤(1)所述发酵液按如下方法制备：将青霉菌Lp.PY-01接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养5d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，蔗糖40g/L，溶剂为蒸馏水，pH为5.6。
7.如权利要求5所述的代谢产物，其特征在于，步骤(1)所述代谢粗产物按如下方法制备：发酵液在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液超声破壁处理后抽滤，滤液用1倍体积乙酸乙酯萃取3次，滤渣用乙酸乙酯浸泡12h，合并有机相，浓缩至恒重，获得代谢粗产物。
8.如权利要求5所述的代谢产物，其特征在于，所述步骤(2)是将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，混合均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中；所述硅胶与发酵粗产物质量比为1:1。
9.如权利要求5所述的代谢产物，其特征在于，所述步骤(3)是将步骤(2)组分E.2用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，混合均匀后，真空干燥，即为吸附组分E.2的硅胶；将吸附组分E.2的硅胶上样于硅胶色谱柱中。
...【技术特征摘要】
1.青霉菌(penicillium macrosclerotiorum)lp.py-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m 20232576，保藏日期为2023年12月15日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述青霉菌lp.py-01在制备抗氧化剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂为青霉菌lp.py-01代谢产物。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂为dpph的清除剂。
5.一种权利要求1所述青霉菌lp.py-01的代谢产物，其特征在于，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将青霉菌lp.py-01发酵液经超声破碎后抽滤，滤液及滤渣分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并浓缩至恒重，获得代谢粗产物；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱速度均为5ml/min，洗脱量均为2～3个柱体积，收集的体积比100:5石油醚-乙酸乙酯的流出液浓缩至干，记为组分e.2；(3)将步骤(2)组分e.2用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比10:1-5:1石油醚-乙酸乙酯为流动相洗脱，收集的体积比6:1的流出液浓缩至干，记为组分e.2-3；(4)组分e.2-3用乙酸乙酯溶解后，以体积比80:20的甲醇-水为洗脱剂进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈建澍，陶昭阳，杨胜利，张慧，刘兴泉，肖功年，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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